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1、2.1.4同名异物小白菜的AFLP鉴定方法模板DNA的制备：（CTAB法）(1) 取2ml离心管盖大小的三片嫩叶放入2ml灭菌的离心管，用相应大小的尖头玻璃棒研磨，使细胞壁充分破碎。(2) 2% CTAB提取液在水浴锅中预热至65。加热前在2% CTAB提取液中加入0.4%的巯基乙醇。(3) 加入750l 2%的CTAB提取液于2ml的离心管中，充分混匀后65水浴1小时，期间每隔10分钟轻轻摇动一次。注意：样品的量不能太多，否则CTAB加入的量太少，细胞裂解不充分。(4) 冷却至室温后，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）轻轻转动摇匀。(5) 保持温度在18以上，13000rpm离心10分钟。
2、注意：温度太低则DNA容易和CTAB结合而沉淀。(6) 用大口径枪头缓慢吸取上清液，重复步骤（4），（5）使溶液中的蛋白和多糖沉淀充分。(7) 用大口径枪头缓慢吸取上清液，加入预先加好600l异丙醇的2ml离心管。注意：吸取2/3的上清即可，不能吸取太多，防止将氯仿：异戊醇或沉淀吸入，降低DNA的纯度。(8) 静置。(9) 13000 rpm离心10分钟，弃上清。加入1ml预冷的70%的乙醇漂洗2次，用无水乙醇漂洗1次。置于超净工作台上吹干1-2小时，或用冷冻真空干燥机抽干。(10) 加入100l 0.1TE或者水溶解DNA，每100l加入0.5l的RNase（2mg/ml），室温放置0.5小
3、时。(11) 取2l DNA，以DNA为对照进行琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度，稀释为100ng/l左右，-20保存。（试剂的配置见附录）AFLP分析的操作步骤(1) 基因组DNA的酶切和连接基因组DNA的双酶切和接头的连接采用一步完成，其反应体系为25.0l，包括：MseI(10U/l)0.5lEcoRI(12U/l)0.5lMseI 接头(50pmol/l)1.0lEcoRI 接头(5pmol/l)1.0l 10ATP 1.0l10NEB(buffer) 5.0l BSA(10mg/ml) 0.25lT4连接酶(3U/l)0.5l基因组DNA(100ng/l) 3.0lddH2O 12.2
4、5ul总体积25.0l离心混匀，37酶切连接反应812小时，酶切连接处理完成后，65水浴处理10分钟，使酶失活，冰浴待用。接头的序列和配置见附录(7)。(2) DNA片段的预扩增将酶切连接产物稀释20倍，按如下体系预扩增：MseI 接头(M+0，100ng/l)0.3lEcoRI 接头(E+0，100ng/l) 0.3l10PCR Buffer 2.0lMgCl2(25mmol/L) 1.5ldNTP(10mmol/L) 0.4lTaq polymerase(5U/l) 0.2l DNA模板4.0lddH2O 11.3l总体积20l混合后，离心数秒，按如下PCR程序扩增:94 5min94 3
5、0sec56 30sec 20 cycles，72 1min72 7 min60 30min4保存。预扩完成后，取5l预扩增DNA产物和5l上样缓冲液(loading buffer)混合后在1.0%琼脂糖凝胶，5V/cm， 1TBE条件下检测预扩增的效果。5l预扩增产物加入95l0.1TE，混合-20保存备用。其余预扩增DNA产物，-20保存备用。(3) DNA片段的选择性扩增扩增体系如下：10PCR缓冲液2.0lMgCI2（25mmol/L） 0.8ldNTP(10mM)0.45lTaq酶(5U/l)0.15lEcoRI引物(50ng/l)1.2lMseI引物 (50ng/l1.2l模板DN
6、A6l加超纯水至20l扩增程序为:94 2min94 30sec65 30sec 13cycles，-0.7/cycle72 1min94 30sec56 30sec 30cycles72 1min72 7min 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将选择性扩增的产物20l中加入变性上样缓冲液8l（98%的甲酰胺，10mM的EDTA，0.25%的溴酚蓝，0.25%的二甲苯青），95变性5分钟，然后在冰浴中迅速冷却。在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶（配方见附录）上电泳1.5小时，电泳仪采用Bio-rab垂直电泳仪。加样量为8.5l。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作规程：(1) 玻璃板的清洗玻璃板是否清洗干净直接关系到聚
7、丙烯酰胺凝胶灌制的质量，干净的玻璃板可以明显防止灌胶时产生气泡。最好提前用洗洁精将玻璃板浸泡一天。洗干净的玻璃板晾干备用。(2) 涂板清洗干净的短板用2%剥离硅胶（配方见附录）均匀的涂在短板上，将0.5%的粘合硅胶（配方见附录）均匀的涂在长板上，千万不能涂错。风干30分钟。(3) 灌胶将长板和短板装配好，调至水平，检查梳子是否合适，取60ml（根据不同型号的电泳槽确定胶的用量）6%的聚丙烯酰胺胶加250l过硫酸铵和50l TEMED轻轻混匀，把板的一边抬起将胶缓缓的灌入。当胶到底部后迅速将板调至水平。将梳子插入适当的位置，聚合2小时以上用于电泳。(4) 预电泳将梳子小心拔出，用洗瓶将插梳子的一
8、端清洗干净，然后擦干净玻璃板，将电泳槽装配好后，在电泳槽中加入1TBE，反向插入梳子至刚与胶面接触，在75W恒功率预电泳30分钟。（不同型号的电泳仪采用不同的恒定功率）(5) 变性将选扩的样品在95变性5分钟，然后在冰浴中迅速冷却，使DNA保持单链状态。(6) 电泳将点样孔中的气泡吹打干净，每孔点样量为8-9l。75W恒功率电泳1.5小时。不同型号的电泳槽所使用的最佳恒定功率不同，以电泳时温度保持在50为宜，电泳的时间以各条带能均匀区分开为宜。银染程序:（试剂配置见附录）(1) 固定 电泳结束后，撬下短板。浸入固定液（10%冰醋酸）轻轻震荡30分钟，至指示染料消失。(2) 漂洗 蒸馏水轻轻震荡
9、洗涤2次，每次5分钟。(3) 染色 将胶板放入染色液（硝酸银1g/L，37%甲醛1.5ml/L）轻轻震荡30分钟。（现用现配）(4) 漂洗 蒸馏水中漂洗一下，迅速取出控水。应在5秒中内放入显色液。(5) 显色 将胶板放入-20预冷的显色液（现用现配）中，并加入硫代硫酸钠（10mg/ml）400l，充分震荡直至条带清晰，背景开始变深为止。温度较高时可加入少量的液氮。(6) 终止 将胶板取出迅速放入10%冰醋酸终止溶液，（第一步操作时用过的）。轻摇5分钟左右。(7) 漂洗 在蒸馏水中轻轻漂洗10分钟以上。(8) 干燥 将胶面放于通风橱中充分干燥。(9) 照相或扫描 将干燥后的胶板进行照相或用扫描仪进行扫描成像。
