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1、人胰岛素的制备一、 获得目的基因从供体细胞中提取mRNA,以其为模板,在反转录酶的作用下，反转录合成胰岛素mRA互补N,再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或NA聚合酶I的作用在,最后合成编码它的双链DNA序列。即得到了目的基因。反转录-聚合酶链反映法(一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA,细胞总RA的提取 ：取胰岛细胞，用S洗后,加入TRIOL试将细胞破裂,后用DEC解决，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。 ,从总A中分离mRNA：取上述提取的总N若干，加入Bufr BB ,Oliotx Sspension ,打匀。70水浴(裂解RNA的二级构造）， 20-30条件下,静
2、置(让liotex与RN结合）。将loex/mRN复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Bffer将其她R洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mN。（二)mNA转录合成cDNA第一链con第一链的合成 加入上步获得的mRNA和合适引物于EP管中,加入RNase-fee ater，混匀后，70反映0分钟,反映完毕后,立即将反映体系置于冰上5min;稍微离心一下，顺序加入缓冲液、 NA酶克制剂、反转录酶、 dNTP（加入放射性同位素利于检查)， 混匀，稍微离心反映物之后,4放置2分钟。取出置于冰上。电泳分析,同位素活性测定。（三）PCR法扩增，特异合成目的D链通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行
3、扩增，特异的合成胰岛素的cDNA链。P法的操作环节：预变性引物退火引物延伸循环235次最后延伸 前端引物: 5-gttcggatct ggt ct ggtcctg tcc cgc gt agt ca ca cac ccac ac cgttt gt aaccaac ctg tgc ggc 后端引物: 5agt gtc gatta tgca gt gt ct ca ct gta-二、 组建重组质粒采用pQE-0质粒作为载体,用双酶切法进行基因重组。1.双酶切法用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DA和外源DNA片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相似的黏性
4、末端可退火连接成重组DNA分子,从而实现DNA的定向连接。重组过程pQ-30用in和mH酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源NA片段同样也用Hind 和Bam酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外源DNA片段混合退火,由于Hind和mH的黏性末端不匹配,避免了载体和外源NA片段的自身连接，外源DNA片段只能定向地连接到载体的Hd 和amH位点之间。固然也不可避免发生载体的ind和am的黏性末端之间的两个碱基互补形成开环，转到大肠杆菌中被修复,但这样的重组子占少数，是低效转化。三、构建基因工程菌(一) 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和B链同步体现法将人胰岛素的A链和链编码序
5、列拼接在一起,然后组装在大肠杆菌半乳糖苷酶基因的下游。重组子体现出的融合蛋白经NBr解决后,分离纯化-B链多肽,然后再根据两条链连接处的氨基酸残基性质，采用相应的裂解措施获得A链和B链肽段，最后通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。重组DNA的转化1, Cl2法制备大肠杆菌感受态细胞：取100 m 菌体培养至OD600 =.,离心收集菌体，用 ml 冰冷的1 m CCl2溶液悬浮菌体,离心，收集菌体，用1 l 冰冷的5mM al2溶液悬浮菌体，冰浴放置12 24小时，备用。2,大肠杆菌感受态细胞的质粒转化:取10 l 感受态细胞,加入相称于50 n 载体的重组,DN连接液,混匀。冰浴放置
6、半小时 。在42 保温 分钟（热脉冲），迅速将转化细胞转移至冰浴中放置1 分钟 。加入1 l新鲜培养基,于37 培养 1 小时（扩增) 。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。典型的al转化措施：a将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟,然后于4下3000g离心1分钟。 b弃去上清,用预冷的0.05o/L的CaC2 溶液1m轻轻悬浮细胞,冰上放置5-3分钟后,4下300g离心10分钟。 c弃去上清,加入4l预冷含1%甘油的005mol/的al2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 d 感受态细胞分装成200l的小份, 贮存于-7。e从70冰箱中取200感受态细胞悬液,室温下
7、使其解冻,解冻后立即置冰上。f 加入pB质粒A溶液(含量不超过5ng,体积不超过10l),轻轻摇匀,冰上放置0分钟后。 g42水浴中热击0秒或7水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却35分钟。 向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp）,混匀后7振荡培养小时,使细菌恢复正常生长状态,并体现质粒编码的抗生素抗性基因(mpr)。 将上述菌液摇匀后取100l 涂布于含p的筛选平板上,正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸取后倒置培养皿,37培养1624小时。(二)重组子的筛选和鉴定(载体遗传标记检测)1.初筛选随机挑取转化单菌落，在LB/A培养基(含00 g/l氨苄青霉素和50ug/m卡那霉素)中
8、进行培养,用Ommol/LPTG诱导体现。体现状况用1SDSA进行分析。2重组菌的后续鉴定直接电泳检测法将初筛选获得的重组菌扩大培养后,提取其质粒DA,通过PCR对其进行扩增,运用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大,用电泳法检测质粒与否为重组质粒。目的蛋白体现检查所得菌体经溶菌酶超声破碎细胞后得到的包涵体进行DSPG分析,所需基因工程菌体现的外源蛋(His)6rg-Arg-人胰岛素原以包涵体形式存在，其分子大小约为13kb，经电泳与胰岛素原marker对比，如条带显示有所需目的蛋白，则所得菌既可做工程菌使用,经扩大培养后，斜面保存以便后续使用。.工程菌的保藏 15%甘油保存菌种，
9、菌液:80,，充足混匀后,-0度保藏。四、 培养工程菌优化发酵条件采用比浊法测定不同步间培养基中菌量,绘制基因工程菌的生长曲线，在摇瓶培养的水平下，采用优化的发酵培养基发酵基因工菌，培养4小时候即进入对数生长期，并且对数生长期可延长至7小时。1，正交优化实验:采用正交法，选用摇瓶培养条件中七个重要因素进行两水平正交优化，该七个因素为:种子活化方式，摇床转速(通风量)，IT诱导温度,接种量,IPTG添加量，诱导时间，补料方式。分别用A、B、C、D、E、G表达.以每升培养基收获湿菌体的量及发酵液的60为目的量,考察条件优化的效果,进行八次实验，对实验成果进行分析,优化出最佳实验条件。2,其她条件优
10、化：在优化发酵条件的基本上，进一步就多种金属元素对苗体生长发重组蛋白诱导的影响作了分析。3,放大培养(比较不同发酵工艺产量）：在优化摇瓶水平发酵实验的基本上,放大至 L培养基中比较两种发酵工艺。在不同转速,通气量，p条件下,比较选择产量最高的发酵工艺。五、 产物分离纯化由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的,因此对产品的纯度规定也要高于老式产品。基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个环节,涉及细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。发酵液进行细胞分离,分别得到胞内产物和胞外产物。胞外产物直接进行透析浓缩然后进行再复性及酶转化,再对产物进行高度纯化
11、，最后制剂即可。胞内产物用溶酶菌或超声波将细胞破碎,细胞破碎后用高速离心法进行固液分离。分离后用变性剂或者离子去污剂得到涉及体,再用变性剂(尿素)使其变形,接着用二次复性法将其复性。对复性后的产物进行透析浓缩,然后进行再复性及酶转化，再对产物进行高度纯化，最后制剂即可。重组蛋白分离纯化的特点重组蛋白质分离纯化的特点为：（1)大多数重组蛋白质产品是生物活性物质,在分离纯化过程中，有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活a(）重组蛋白质产品在物料中含量很低，凰物料构成非常复杂。例如,运用基因工襁菌发酵生产蛋白藤,物料中具有大量缀成复杂的培养基、荣体生产代谢物等,疆拣蛋鑫囊魏含量嚣豢
12、不瑟蛋鑫凄慈爨鹃。舂些嚣拣鬣囊矮存在予缀懿武或在胞内形成涉及体,为获敬蛋白质，还需避行细脆破碎，结鬈物料中具有大量的细胞碎片和胞内产物。（3）含蛋白质产晶的物料不稳定，蛋白质产品易受料液中蛋自水解酶降解。(4）诸多熏组蛋白质产品作为医药、食品被人炎运用,因而规定蛋国艨产器必绥是裹癀缝铯瓣，产蘸无萤、兹致热源等。与老式麓生物大分子分离方式楣镄,蘩缀蛋臼的分离纯纯恣憝秘用其携理稻化学性质的差别，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、祭疏水性以及与其他分子的亲和性等性质建立起来的。二次复性法:0.5g包涵体溶解于一定量的缓冲液（50molGlyNO,8 molL尿素，B巯基乙醇，p 9.）中,使之充
13、足混悬，静置1小时以上。混悬液分步逐滴加入到缓冲液(5mmol/LGl-NaO,半胱氨酸一胱氨酸， 95）中,4静置复性过夜。上样于已用0mmol/LlNaOH(pH 9.5)平衡的DEA-Sepharse FF柱,用1olL的氯化钠梯度洗脱,通过S-PAE拟定RRPI位置，用DEA-Sepharose FF做离子互换层析,收集含RhPI的洗脱峰,层析图谱见（图6）。电泳检测显示(图11)峰2重要为RRhPI，及少量高分子杂质,收集峰2做再复性。峰1为pH高于9.5及某些疏水性蛋白质形成的穿透峰,绝大部分pH低于RhI的蛋白质和核酸类杂质则牢固地结合在柱子上，在较高盐浓度及2mol/L NaC
14、l的条件下被洗脱下来，形成其她峰3和峰4。胰岛素原(RRhP）的再复性及酶切转化：,复性将初步复性及纯化后的RRhI通过透析浓缩，先后转换到缓冲液和D(50mmo G1NOH，氧化型谷胱甘肽(GS)一还原型谷胱甘（GS)H)中,使蛋白浓度为0.1O.6 ml，4静置过夜。2，酶切复性后的RRI复性液调节pH后加入一定量的胰蛋白酶(trpsi)和羧肽酶B（carxypptidase ）在37。C进行协同酶切一段时间，然后滴加 oZCI：至Znl:浓度为01ml/L终结反映并沉淀生成的h，用双蒸水洗涤沉淀得较纯9重组人胰岛素约79 mgL培养基。重组胰岛素粗品的纯化:胰岛素粗品用.2 mol/L aAcHAc,pH.0溶解。溶解后的样品通过Superdex75进行纯化(图0),得1、2、3峰,收集峰3，透析后冻干即为胰岛素产品所得胰岛素产品用SD-PG分析为单带，电泳检测见图。六、 除菌过滤 老式过滤只能滤去空气中的尘埃、液体中的异物微粒，很难清除微生物活体(细菌、病毒及热原体）；薄膜过滤是微孔筛分,不小于孔径的微粒均被截留，微生物粒子大小为0.5-微米，只要选用0.45微米 的微孔滤膜即可将微生物截留清除，用0.
