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1、荧光显微镜(Fluorescence microscope)操作及海洋细菌微藻观察一. 实验目的 了解荧光显微镜使用原理 了解荧光显微镜标本制作要求 了解使用荧光显微镜的注意事项 荧光图像的记录方法掌握荧光显微镜对细菌及微藻的观察，提交实验报告（包括拍摄图片） 二 实验原理某些物质经一定波长的光（如紫外光）照射后，物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态；当其从激发态返回到基态时，所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外，其余较大部分则以光能形式辐射出来，由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的光的波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光部就是荧光(fluorescence
2、)。所谓荧光就是某些物质在一定波长光（如紫外光）的照射下、在极短时间内所发出的比照射光波长更长的可见光。由此可见，被照射物质产生荧光必须具备以下两个条件：物质分子（或所特异性结合的荧光染料）必须具有可吸收能量的生色团；该物质还必须具有一定的量子产率和适宜的环境（如溶剂、pH、温度等）。 荧光显微术是利用荧光显微镜结可发荧光的物质进行观测的一种实验技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时, 就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如见光)，这种光就称为荧光。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接产生荧光, 称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素
3、的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不能产生荧光，但它吸收荧光染料后同样却能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后便可发出桔红色荧光。 荧光显微镜具特殊光源（多为紫外光光源），提供足够强度和波长的激发光，诱发荧光物质发出荧光。在视场中所所观察到的图像，主要是样品的荧光映像。 三荧光显微镜标本制作要求（一）载玻片载玻片厚度应在0.81.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。（二）盖玻片盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，
4、这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。（三）标本组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。（四）封裱剂封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.59.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。（五）镜油一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡
5、也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。四 使用荧光显微镜的注意事项（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯515min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。（4）检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射35min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过23h。（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记
6、录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。（7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”无或可见微弱荧光。“+”仅能见明确可见的荧光。“+”可见有明亮的荧光。“+”可见耀眼的荧光。五荧光图像的记录方法荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上可靠的。随着技术科学的发展，在不同程度上采用客观指标
7、记录判断结果，如用细胞分光光度计，图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上或24。以上。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。六体视荧光显微镜使用方法与注意事项使用方法： (1)将材料片放在载物台上。 (2)开启荧光显微镜稳压器然后按下启动组点燃紫外灯15min内不
8、得关闭，关闭后3min内不得再启动。 (3)将激发滤光片转至v，分色片调到v，选用495或475nm阻挡滤光片。 (4)选用uvFL40、uvFL100荧光接物镜镜检。 (5)在玻片上加无荧光油，先用40 x，再用100 x调焦镜检呈现荧光。 (7)因荧光物质受紫外光照射时随时间的增长荧光逐渐变弱，因此镜检时应经常变换视野。 (8)亦可用uvFL10或uvFL20低倍镜镜检材料(用低倍镜时不加无荧光油)。 七荧光显微镜操作程序1.开机：1.1.打开房间总电源开关1.2.打开电脑电源开关1.3.打开数码相机电源开关1.4.打开显微镜电源开关（打开汞灯电源开关）2.调试显微镜光路：2.1.把载玻片
9、放到载物台上。调节聚焦。2.2.根据物镜指数乘0.8确定聚光镜光圈值，调整到位。2.3.将视场光阑缩小，然后调节聚光镜高度，直到从目镜中观察到视场光阑的清晰成像。2.4.放大视场光阑，使其在目镜中的黑框扩展到视野以外。3.调试数码相机拍摄照片：3.1.在显微镜取景器中对好视野及焦距。3.2.打开photoshop程序。3.3.点击 “文件 - 自动。”调出相机控制窗口。3.4.ZOOM定为77。拍摄图片格式为640*480。3.5.在相机控制窗口上点preview，观察预览图象的亮度。选择适当的曝光时间使预览图片的亮度合适。3.6.点拍摄按纽拍摄，等待几秒钟后图片传回电脑并在photoshop
10、窗口里显示。3.7.继续拍摄下一张照片。3.8.拍摄十来张照片后要及时保存照片。3.9.先关闭相机控制按纽。并保存拍摄条件到默认值。3.10.在photoshop中保存刚拍摄的照片到指定文件夹中，保存后要关闭照片。3.11.保存并关闭全部照片后重新打开相机控制窗口继续拍摄。3.12.拍摄全部完成后保存所拍摄的照片。需要时将照片通过网络上传到校园网服务器上，不能使用U盘或软盘转移文件。或者将照片文件刻录到光盘上。4.关机：4.1.关闭显微镜电源。4.2.关闭汞灯电源。4.3.关闭数码相机电源。4.4.关闭电脑时点“重新启动电脑”，待电脑进入关闭状态并重新启动时按电脑电源开关强制关机。注意不能直接点击“关闭电脑”。4.5.关闭房间电源总开关。注意事项：1、 不要污染物镜镜头。一旦污染，先用擦镜纸擦除一遍，再用显微镜专用擦洗液擦洗，最后用镜纸再擦一遍。用油镜镜头后，以同样方法擦洗。2、 关闭显微镜电源前，先把光源调到最低。3、 用过荧光镜的，注意清洁载物台，防止有害有毒致癌物污染。4、 结束工作，关闭所有电源，清洁工作台和房间。5、 发现漏电和其他故障，及时报告。
