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1、实验四 培养基的制备和灭菌一、 目的要求1、 了解并掌握培养基的配制、分装方法2、 掌握各种实验室灭菌方法及技术二、 基本原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。 琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98100下融化，于45以下凝固。但多次反复融化，其
2、凝固性降低。 任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。三、 器材1、 溶液或试剂 蛋白胨、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4等等见培养基配方。2、 仪器或其他用具 电子天平、高压蒸汽灭菌锅、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿、玻璃棒、烧杯、试管架、酒精灯、电炉等。四、 操作步骤基本流程：称药品溶解调pH值融化琼脂过滤分装包扎标记灭菌摆斜面或倒平板。1、 称量药品 根据培养基配方及配制量依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋
3、白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2、溶解 用量筒取一定量(约占总量的2/3)蒸馏水倒入烧杯中，在电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。3、调节pH 根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。4、溶化琼脂 固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。5、分装 分
4、装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的2/3为宜。6、包扎标记 培养基分装后加好硅胶塞或试管帽。在在瓶壁或管壁上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。7、灭菌培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121 20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜。7.1高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微
5、生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121，经1530min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌7.2操作方法和注意事项如下 :7.2.1加水 打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。 7.2.2装料、加盖 灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。 7.2.3排气打开排气口(也叫放气阀)。分别设定所需灭菌温度
6、和时间（锅体上的定时器为一压控开关）。接通电源加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。 7.2.4升压、保压和降压 当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，灭菌锅自动控制加热开关以维持恒温，待设定时间到达（一般培养基和器皿灭菌控制在121，20min）后，自动停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。8、无菌检查将已灭菌培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。本实验分离用培养基的配方:A
7、1/5NB培养基(各成分取1/5) 营养肉汤（nutrient broth)培养基（1L）：牛肉膏（beef extract） 3g /l；蛋白胨 (soy peptone) 5g /l；pH 7.0B喹啉降解菌分离用培养基 单位 g/LNa2HPO4 1.6KH2PO4 1.0NH4Cl 0.5K2SO4 0.06CaCl22 H2O 0.025MgCl26 H2O 0.1NaHCO3 0.42EDTANa2 0.015FeSO47H2O 0.0015D-BIOTIN 0.010KNO3 0.505配制时每一成分逐一溶化，否则会产生沉淀。以喹啉作为唯一碳源时，喹啉的加入量为0.52 mmol
8、/L（或40ul/L150ul/L）。对于固体培养基，喹啉的加入量为每块平板2ul10ul喹啉(置于培养基表面)。*喹啉要在培养基灭菌后加入制备固体分离培养基时需加入1.5g agar/100ml培养基。C反硝化富集培养基 单位 g/LNa2HPO4 1.6KH2PO4 1.0NH4Cl 0.5K2SO4 0.06CaCl22 H2O 0.025MgCl26 H2O 0.1NaHCO3 0.42EDTANa2 0.015FeSO47H2O 0.0015D-BIOTIN 0.010KNO3 0.505乙酸钠 1酒石酸钠钾 2 * 喹啉（苯酚） 40ul（300mg） 配制时每一成分逐一溶化，否则
9、会产生沉淀。 *喹啉（苯酚）要在培养基灭菌后加入制备固体分离培养基时需加入1.5g agar/100ml培养基。D. 1/10TSA(Tryptic soy agar)培养基（各成分取/10）：胰蛋白胨 15 g/l, 大豆胨 （Soytone） 5 g/l, NaCl 5 g/l, 琼脂 15 g/lE苯酚降解菌分离用培养基 单位 g/LNa2HPO4 1.6KH2PO4 1.0NH4Cl 0.5K2SO4 0.06CaCl22 H2O 0.025MgCl26 H2O 0.1NaHCO3 0.42EDTANa2 0.015FeSO47H2O 0.0015D-BIOTIN 0.010KNO3
10、0.505配制时每一成分逐一溶化，否则会产生沉淀。以苯酚作为唯一碳源时，苯酚的加入量为200800 mg/L。苯酚要在培养基灭菌后加入制备固体分离培养基时需加入1.5g agar/100ml培养基。FR2A培养基酵母提取物 0.50 g /l胰蛋白胨 0.25 g /l大豆胨 （Soytone） 0.25 g/l, 酸水解酪素 0.50 g /l葡萄糖 0.50 g/l 可溶淀粉 0.50 g /l丙酮酸钠 0.30 g/l K2H PO4 0.30 g/l MgSO47H2O 0.05 g/l 琼脂 15.00 g /l在加入琼脂前用结晶的磷酸氢钾或磷酸二氢钾调整最终PH值为7.2。加入琼脂后，加热培养基使其沸腾，琼脂溶解后在121高压灭菌15分钟。LB液体培养基配方 蛋白胨 10g 酵母粉 5g NaCl 10g H2O 1000ml pH7.2五、 思考题1、 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？2、 你所配培养基的用途是什么？并说明其理由。3
