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1、. .基因的克隆、表达载体构建及功能验证一般性方法一、 基因克隆 事前三问a.克隆这个基因干什么.它有什么功能.b.这个基因在哪种材料中扩增.c.材料需要怎么处理. 实验前准备工作a.设计引物，准备材料，b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂盒c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+、Kan+等抗生素准备 根本流程 提取和纯化RNAcDNA第一条链合成PCR凝胶电泳胶回收连接转化涂平板挑单菌落摇菌提质粒测序1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成1.1叶片、根总RNA的提取Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，含异硫氰酸胍等物
2、质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。1） 实验前准备预先配制0.1%的DEPC水ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37过夜处理12h，高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200灭菌至少4h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购置)。2) Trizol 法小麦叶片或根的总RNA实验步骤如下：1提前在1.5ml离心管中参加1mlTrizol，然后将200mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管，用力摇15s，在15-30温育5min，使核酸蛋白复合物完全别离。24，12000g离心10min，取上清，离心
3、得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。3吸取上清液加0.2ml氯仿，盖好盖，用力摇15s，1530温育23min。4在12000g，4离心10min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。5将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。6在12000g，4离心10min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。7用1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在7500g，4离心5min，弃上清。（8） 室温放置枯燥或真空
4、抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100l用枪头吸几次，5560温育10min使RNA溶解。9配制以下体系：10DNase buffer 5lDNase I RNase-free40 g/l 1lRNasin Inhibitor40 g/l 1lTotal RNA 70 g加去RNase水至总体积为50l1037 水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100l，参加等体积氯仿抽提一次。11取上清，参加10l的3 mol/L NaAC溶液，200l的无水乙醇，-80 沉淀30min。1228 ，12000g离心10min，弃清液，枯燥后取50l无RNase的水溶解RNA。3R
5、NA的质量及纯度检测1电泳检测 取2ul RNA 与1ul 10Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。2分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质量。4 cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA：1） 在Eppendorf管中配制以下混合液：试剂名称 使用量模板RNA 1 gOligo dT primer (50 M) 1 ldNTP Mixture(10mM) 1 lRNase free dH2O up to
6、10 l2 65保温15min 后迅速在冰上急冷2min。3 离心数秒使模板RNA/引物等的混合液聚集Eppendorf管底部。4 在上述Eppendorf管中配制以下反转录反响液:试剂名称 使用量上述模板RNA/引物等的混合液 10 l5Frist-Stand Buffer 4 lRNase Inhibitor(40U/ l) 0.5 lMTV RTase (10U/l) 0.5 lRNase free dH2O up to 20 l5 37保温60min。6 95,5min后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。1.2小麦胚及胚乳总RNA的提取1配制RNA抽提buffer，50 ml
7、中含有：1M Tris-HClPH 9.0 2.5 ml4MNaCl 1.5 ml10%SDS 5 mlDEPC-H2O 41.25 ml2取以上RNA提取液650 ul，加350 ul水饱和酚，放入1.5 ml离心管中，65 水浴预热。3研磨0.3 g材料，直至呈粉末状，待液氮刚刚挥发，迅速参加到上述预热的提取液中，立即剧烈震荡，约10 min。4再参加400ul氯仿，抽提10 min，12000rpm 4 离心10 min。5取上清，参加等体积的氯仿，混匀摇10 min，12000rpm 4离心10 min。6取上清，加1/3体积的8 M氯化锂，4 保存过夜。7离心10 min，弃上清液，
8、留沉淀，用75%乙醇洗1次，再用无水乙醇洗5-10 s，晾干，溶于80 ul DEPC水中。8参加9 ulDNA酶(无RNA酶)，10 ul 10bufferDNA酶所带和1 ulRasinRnas抑制剂，37 30分钟再加500 ul水9取出用 300 ul氯仿和 300 ul苯酚抽提，摇10 min钟，静止10 min，12000 rpm 4 离心10 min。10取上清，参加等体积的氯仿，摇10 min，静止10 min，4 离心10 min。11取上清，加1/10 NaAC3M，PH 5.2，再加2倍体积的预冷无水乙醇， -80 冰箱过夜；1012000rpm离心15 min，弃上清液
9、，留沉淀，晾干，溶于40 ul DEPC水中，电泳检测其完整性，保存于-80，备用。 .1 cDNA第一条链的合成（1） 基因组DNA的去除反响试剂 使用量5xgDNA Eraser Buffer 2.0 ulgDNA Eraser 1.0 ul Total RNA 5 ulRNase Free dH2O up to 10.0 ul 42 2 min 4 10 min(2) 反转录反响试剂 使用量5xPrimeScriptBuffer 2(for Real Time) 4.0 ulPrimeScriptRT Enzyme MixI 1.0 ulRT Prime Mix 1.0 ul的反响液 1
10、0.0 ulRNase Free dH2O up to 20.0 ul 37 15 min 85 5 sec 4 10 min -20 保存备用2.基因cDNA克隆2.1基因片段的PCR扩增以反转录后的cDNA为模板进展PCR扩增。PCR反响体系为20ul：10PCR Buffer 2.0 ul，2.5 mM dNTPs1.6ul，10 mM上下游引物各0.8 ul，Taq 酶0.3 ul，模板cDNA1.0ul，ddH2O补足至20ul。按照以下条件进展PCR扩增： 94 4min 94 30sec 50 40sec 30cycles 72 1min 72 10 min 2.2PCR扩增产物
11、的检测和回收纯化PCR扩增产物在1% 琼脂糖凝胶(含有 0.5ug/ml溴化乙锭)上进展电泳，在紫外灯照射下进展观察，与标准分子量进展比较估测扩增DNA片段的大小，假设与预计的大小相符，那么使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将扩增出的片段回收，主要操作步骤如下：1) 在紫外灯下切下将要回收的条带(尽量使用长波长的UV)，称重。2) 按每 100mg 琼脂糖胶参加300ul溶胶液PN，置于50水浴中 10min，每隔2min混匀一次，使胶彻底融化，室温放置2min。3) 将UNIQ-10柱放入2ml的收集管中，参加600ul平衡液BL，13000rpm，离心30sec。3) 取下UNIQ-10柱，倒
12、掉收集管中的平衡液，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10柱中，静止2-3 min，13000rpm，离心30sec。4) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，再放回收集管中，参加700ul漂洗液PW(使用前先检查是否已参加无水乙醇)，13000rpm离心30sec。5) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，放回收集管中，参加 500ul漂洗液PW，13000 rpm离心30 sec，重复一次。6) 取下UNIQ-10柱，倒掉废液，放回收集管中,13000rpm，离心2min。7) 将UNIQ-10柱放入一新的1.5 mlEp管中，在柱子的吸附膜中央悬空滴加50 ul预热70洗脱液EB，室温放置5min。8) 12000rpm，离心lmin，Ep管中液体即为回收的DNA片段，-20保存备用。2.3 回收产物与PMD-T载体的连接与转化 采用TAKARA公司的PMD-T载体进展连接反响，感受态细胞DH5a作为转化细胞进展转化。具体操作步骤如下：SolutionI、PMD18-T或19-T、DNA回收产物置于冰中溶解。 在0.2ml离心管中配制反响体系10ul：PMD18-T载体0.5ulSolutionI
