一株大熊猫粪便纤维素菌的分离及鉴定

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1、一株大熊猫粪便纤维素菌的分离及鉴定纤维素分解性细菌(cellulose decomposingbacteria) 一般寄宿于反刍动物的瘤胃中，大 熊猫基本上为草食性动物，主食为纤维素含量高的竹子，但它对粗纤维的消化率仅为51% 左右。在人工条件下，如果提高纤维分解菌的活性可大大提高该细菌群体对竹子的转化率。 所以加强这方面研究，提高大熊猫对竹子的消化利用率将是一个突破点，具有很好的前景。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物实验中采集的粪便微生物样品来自于兰州市动物园“蓝宝”(下文缩写为LB，雄性，5 岁，76kg)和 “蓝仔”(下文缩写为LZ，雌性，4岁65kg)。“蓝仔”于2007年7月

2、29日、“蓝 宝”于2007年8月1日从成都大熊猫繁育研究基地引进，均在配有空调的馆内饲养。其中 两只大熊猫均独自圈养、可在户外独立活动(35.0 X15.0mm2)、健康、无腹泻病、1月内未 使用任何抗菌药物，试验期间所饲喂的食物为：牛奶、鸡蛋、竹子、竹笋、红萝卜和纤维素 饼干。纤维素饼干的成分为：玉米粉、面粉、黄豆粉、大麦粉、白糖、食盐、肥儿粉、麸皮、 绿豆粉、奶粉、快长素和骨粉。水源供应充足。1.1.2培养基1.1.2.1 富集培养基(L-1)： (NH4)2 SO4 4.0g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 2.0g，NaCl 0.5g，结晶纤 维素1.88g，琼脂16.0g，自然

3、pH。1.1.2.2 分离培养基(L-1)： (NH4)2 SO4 4.0g，MgSO4 0.5g，KHPO4 2.0g，NaCl 0.5g，结晶纤 维素1.88g，琼脂16.0g，刚果红Og，土壤(西北民族大学教工公寓前未开垦的地下50-60cm) 浸出液 100ml，水 900ml，pH 7.0。1.1.2.3 复筛培养基(L-1)： (NH4)2SO4 0.2 , MgSO4 0. 05 , KH2 PO4 0. 1 , NaCl 0. 05 ,纤维素 粉2. 0 ,刚果红0. 02，琼脂2. 0 ,自然pH。以上培养基121 C灭菌15min。1.1.3试验主要试剂及仪器OLYMPUS

4、 BX-51荧光倒置相差显微镜 OLYMPUS IX-71荧光倒置显微镜 菌落自动计数 仪UV1601紫外分光光度计 GC-8A气相色谱仪 BCN-1360超净工作台1.2方法1.2.1采样用无菌器械采集大熊猫上午采食前所排出的新鲜粪便，密封于无菌厌氧袋，临时保存于 盛冰的冰壶中。采回的样品尽可能早地 进行初处理。该实验中，对“蓝宝”，分别于 2008-11-19,2008-12-22采了 2次样(下文中样品号分别记为LB1，LB2)；对“蓝仔”，分别于 2008-11-03,2008-12-16采了 2次样(以下样品分别记为LZ1，LZ2)。1.2.2样品的初处理称取粪便团 10g 溶于盛

5、100 ml 灭菌 PBS(0.137 mol/L NaCl，2.68 mmol/L KCl，7.98 mmol/L Na2HPO4，1.47 mmol/L KH2PO4，pH7.4)容量为 500 ml 的无菌烧杯中，用磁力搅拌 器不断搅拌，镊子夹出未消化的残渣，清洗残渣；将液体倒入1000 ml的烧杯中，残渣再溶 于200 ml PBS，收集洗液，将2次液体合并，分装于200 ml离心管中，漩涡510min，低 速离心(200 r/min)3 min，收集上清；然后高速离心(9 000 r/min)5 min，收集沉淀，用5 mlPBS(依菌体沉淀的多少而定)悬浮沉淀，再高速离心(9 00

6、0 r/min)5 min,收集沉淀并用PBS 悬浮沉淀，分装备用。1.2.3样品的接种及培养将样品管置于37温箱培养24 h后，革兰氏染色镜检，观察有无细菌生长。将初处理 后的样品振摇均匀后作系列梯度稀释至10-1Q每支定量滴定管预先滴定校正，选择滴数一 致的定量滴定管灭菌后备用。各取每个稀释度0.2 ml分别接种血平板置于37温箱培养24 h，观察菌落生长表现。如菌落疏密恰当，便于菌落统计，按此稀释度接种培养基。样品稀 释后取适当稀释度样本液10UI于培养基表面，用涂布法接种，每稀释度作三次重复。分别 在25C、37C下进行需氧培养。培养物按伯杰氏系统细菌学鉴定手册进行鉴定，并计数菌 落数

7、，用菌落形成单位(CFU)表示。1.2.4菌落观察与挑纯观察固体培养基上菌落生长的形态，结合镜检，分辨、归类不同的菌落进行计数，筛选 出优势菌株及对特殊培养基培养出的菌株进行统计。采取划线分离法，分别对需氧菌和厌氧 菌进行挑纯培养，直到分离到纯培养物。1.2.2.4芽抱鉴定将分离到的革兰氏阳性杆菌接种于锰培养基平板，置于37C温箱培养18-24 h，革兰氏 染色镜检，观察其有无芽抱生成。1.2.2.5菌种保存需氧菌用血斜面保存，厌氧菌用厌氧肉肝汤保存。1.2.3细菌鉴定对挑纯的菌株进行生化试验。根据菌落形态、镜检和生化结果，参照有关资料，综合判 断，确定菌株。1.2.3.1优势菌株的确定按下述

8、两个条件确定优势菌株，一是此菌株在多个大熊猫粪样固体固体培养第二章健康 大熊猫消化道正常菌群的分离与鉴定21物中可见到，二是此菌株在固体培养基上的菌落个 数占优势。1.2.3.2生理生化特性试验(1) 需氧性鉴定将所检菌种接种于普通肉汤，置于37C培养2448 h，观察细菌是否生长。(2) M.R 与 V-P将待检菌接2管葡萄糖蛋白胨水溶液，置于37C下培养2448 h。取出其中一管培养 物加入35滴M,R试剂，变红色者为阳性反应。另一管做V-P试验，取出24 h培养物1 ml， 将6% a -萘酚酒精溶液0.5 ml加入，随后加16%KOH 0.5ml,轻摇，然后让其静置10-15 min,

9、 在15 min内出现红色者为阳性，1 h后可出现 假阳性。(3) 接触酶试验用接种环将一菌落放于载玻片的中央，加一滴3%H2O2于菌落上，立即观察有无气泡 出现，有气泡者为阳性反应。(4) 明胶试验将待检菌接种于明胶培养基，置于22C下孵育，观察明胶液化状况。明胶低于20C凝 成固体，高于24C则自行呈液化状态，因此孵育温度最好在22C，但有些细菌在此温度下 不生长或生长极为缓慢，则可先放在37C培养，再移置于4C冰箱经30 min后取出观察， 具有明胶液化酶者，虽经低温处理，明胶仍呈液态而不凝固，按阳性反应对待。(5) 硝酸盐还原试验用待检菌纯培养物接种于硝酸钾蛋白胨水，置于37r培养18

10、24 h,再加试剂甲和乙 各35滴，在30 S内出现红色即为阳性。若无颜色出现，加少量锌渣，随后出现红色则是 真阴性试验。(6) 吲哚试验将待检菌接种于邓亨氏蛋白胨水溶液中，置于37r温箱培养2448 h后，于培养液中 加入二甲苯23 ml，摇匀，静置片刻，沿试管壁加入欧立希氏试剂2ml，在二甲苯下面的 液体变红者为阳性反应。(7) 糖和醇发酵试验用接种针挑取少量待检菌穿刺接种于各种糖发酵管深部(勿穿到管底)，将接种管标记 清楚放入37r孵育，2448 h观察结果。(8) 柠檬酸盐利用试验将待检菌单个菌落划线于西蒙氏柠檬酸钠琼脂斜面培养基，并在37r培养24-48 h后观 察，培养基颜色变蓝者

11、为阳性。(9) 嗜盐性试验将待检菌分别接种于2%、5%、7%、及10%氯化钠培养基，置于37r温箱培养24-48 h， 观察试管溶液混浊度并进行镜检，溶液混浊并检出待检菌者为嗜盐生长。2.2.2综合鉴定结果根据生化结果，菌落的生长表现(大小、形状、颜色、边缘状况、表面隆起度、透明度 等)和革兰氏染色特性及菌体形态进行综合分析，查阅伯杰氏细菌鉴定手册79和常 见细菌鉴定手册80，得出最终判定结果如下：第二章健康大熊猫消化道正常菌群的分 离与鉴定25参考叶姜瑜的纤维素刚果红平板透明圈筛选法l8v】。纤维素刚果红平板透明圈直径 (D)与菌落直径(d)的比值(D/d)可用于初步判断纤维素降解菌酶活力的

12、大小，其大小直 接反映了纤维素酶浓度的相对高低【881。叶姜喻一种纤维素分解菌鉴别培养基。.微生物学通报1997, 24(4):251 一 2522.2.5.1纤维素酶活测定方法纤维素降解菌酶活力的复测参考王琳哪】的方法，采用DNs法测定纤维素cMc 酶活力。每分钟产生1pg葡萄糖定义为1个酶活力单位(u)。王琳DNS法测定纤维素酶活力最适条件研究J河北师范大学学报(自然科学版)，1998，26(3)66-69将大熊猫肠道纤维素分解菌的菌原液转入52m0l血清瓶中，用YP培养基进 行富集，待滤纸条完全崩解后转种至液体管中活化。在厌氧条件下，将富集后的 样品滚管，培养一周左右，当有透明圈的菌落逐

13、渐明显和加大时，用弯尖的毛细 管吸取单一菌落，接种至液体厌氧管中，待滤纸崩解以后，再进行稀释滚管。如此 重复滚管若干次，进行纯化，直至滚管中菌落形态一致，大小均一，液体管中细胞 镜检形态大小一致，即认为己得到纯菌株。2.2大熊猫肠道厌氧纤维素分解菌的生理生化特征2.21菌株大小及菌落形态观察2.2.1.1光学显微镜下现察涂片固定后用草酸按结晶紫染1分钟，经自来水冲洗后加碘液覆盖涂面染1分钟。再次用自来水冲洗，用吸水纸吸去水分。加9%5酒精数滴，并轻轻摇动 进行脱色，03秒后水洗，吸去水分。最后用蕃红染液染10秒钟后，自来水冲 洗。干燥后光学显微镜下观察。2结果2.1菌落形态分离的菌株在结晶纤维

14、素固体培养基中培养72h，形成乳白色的菌斑，菌斑周围是透明 的水解圈，水解圈的边缘整齐，直径约13mm，透明的圈内的纤维素分解菌在降解过程中 不产生色素（如图）。3讨论1. 其客观原因一方面可能为该年龄段内肠道正常菌群生理特点，另一方面可能也与试验样本 数较少、食谱结构及饲养环境的不同等有一定联系，确切原因尚有待深入探讨。同时，本试 验还表明受试成年大熊猫肠道正常菌群的结构与其它动物比较有明显差异，2. 肠道正常菌群与动物的营养及消化生理有极密切的关系，主要表现在合成宿主所需的维生 素及参与脂质、糖、淀粉代谢和蛋白质的合成与分解。特别是在大多数反当动物及单胃动物， 这种关系尤其明显。大熊猫基本

15、上为草食性兽，主食竹子，纤维素含量高，但研究表明，它 对粗纤维消化率仅为51%左右，明显低于其他草食性兽，相对其采食量，其排粪量也较多; 同时它对蛋白质、碳水化合物等营养成分的吸收率也较低，这可能与其原籍菌结构特点及相 应生理性专性厌氧菌较少等有密切关系，这种微生态结构特点可能还与大熊猫其他消化生理 及行为生态上的特点有关。3. 正常菌群受年龄、遗传、免疫、食物、疾病、精神状况等生理和病理因素影响，因采样难 度和条件限制尚未对上述方面进行研究;特别是进一步研究大熊猫幼仔出生后至成年这一过 程中肠道正常菌群的“演替”，对于这阶段内正确防治疾病，确保幼仔成活及其消化生理有 积极意义。另外，条件允许还应扩大试验样本数，并对菌群定位等作进一步研究。熊猫肠道纤维素分解菌PD发酵纤维素主要代谢产物是乙酸，对维持大熊猫 肠道的内环境的稳定有一定的作用。这对于大熊猫肠道微生态研究有一定的意 义。同时通过更深一步的研究，可以更好地了解大熊猫消化的机制，为大熊猫 的生理代谢提供理论基础，并可能为大熊猫的保护提供帮助。参考文献