CLA 对 HepG2 细胞脂肪堆积的影响 【摘要】 目的 研究共轭亚油酸对 HepG2 细胞中脂质沉积的影 响方法 以 HepG2 细胞为研究对象，以不同浓度 CLA（10mmol·L-1、 50mmol·L-1、100mmol·L-1）作用细胞 24 小时，采用油红染色、 RT-PCR 等方法检测肝脏脂肪沉积、ACC mRNA 表达，观察 CLA 对肝细胞 内脂质沉积的影响结果 CLA 增加 HepG2 细胞中脂质沉积，50m mol·L-1CLA 组细胞中红染脂滴与对照组相比明显增多；CLA 使 HepG2 细胞培养液中游离脂肪酸降低，50mmol·L-1 组的培养液中游离脂肪 酸与对照组相比含量降低了 50%（P< 0.05） CLA 增加 HepG2 细胞 ；ACC mRNA 的表达， mRNA 表达水平随 CLA 浓度增加而增高 ACC 结论 CLA 可增加 HepG2 细胞的脂肪沉积；其机制可能与 CLA 能够改变肝细胞中 ACC 的表达有关 【关键词】共轭亚油酸 (CLA) HepG2 细胞 脂肪代谢 ACC 共轭亚油酸(conjugated linoleic acids，CLA)是由一组具有共 轭不饱和双键的亚油酸的异构体构成的混合物。
1987 年 Michael Pariza 研究小组分离出 CLA，能够抑制化学诱导的皮肤肿瘤形成[1] CLA 有减轻肥胖、抗肿瘤、防止动脉粥样硬化、提高机体免疫力、增 加骨密度、促进生长等多种生理功能但是一些研究发现，CLA 在减 少体内脂肪的同时，可能出现肝脏脂肪代谢障碍，出现肝脏脂肪沉积 的现象，其确切的分子机制尚不明确[2]本实验就是研究 CLA 对肝脏 细胞脂肪堆积的影响 1 材料 11.1 HepG2 细胞 第四军医大学营养与食品卫生学教研室惠赠 1.2 主要试剂 高糖 DMEM 培养基，Gibco 公司；新生小牛血清，杭州四季青； 胰蛋白酶，Wolsen 公司，四甲基偶氮噻唑兰(MTT)，Amresco 公司；油 红 O-0625，Sigma 公司，共轭亚油酸（CLA） Sigma 公司；游离脂肪 ，酸测试盒南京建成科技有限公司；TRIZOL，Invitrogen 公司；反转录 试剂盒 Fermentas 公司葡萄糖试剂盒，上海复星公司 1.3 主要仪器与设备 NU-2500E 型 CO2 孵箱，倒置相差显微镜，YI-875SA 医用超净工 作台，酶联免疫检测仪，MyCycler thermal cycle，凝胶成像仪等。
1.4 引物 引 物 由 奥 达 公 司 合 成 ， 其 中 ACC 引 物 为 ： 5 ' -TGATGTCAATCTCCCTGCAGC-3' 5'- TTGCCTCTTCTCTGTTTTCTCCCC-3' ； b -ACTIN 引 物 为 ： 5 ' -AGCGGGAAATCGTGCGTG-3;5 ' -CAGGGTACATGGTGGTGCC-3' 2 实验方法 2.1 细胞培养 HepG2 细胞置于含 10％新生小牛血清的高糖 DMEM 培养液中，含 有 100 IU/ml 青霉素，100mg/ml 链霉素，37℃、5％CO2、饱和湿度 的恒温孵箱条件下培养，用胰蛋白酶消化液消化 2.2 油红 O 染色观察 HepG2 细胞脂质沉积 2将 HepG2 细胞接种于放有干净盖玻片的 6 孔板内，37 ℃、5%CO2 及饱和湿度条件下培养待细胞长至 80%满时，吸弃培养液，加入不 同浓度 CLA 作用 24 小时后，终止培养；弃培养液，每孔加入 1ml10% 的甲醛溶液室温孵育 5 分钟除去甲醛溶液，加入同等体积的 10%甲 醛室温孵育 1 小时，用锡纸包封好避免干燥；除去甲醛溶液，60%的异 丙醇冲洗，完全干燥；加入油红 O 工作液放置 10 分钟，除去油红 O 立即用蒸馏水冲洗 4 次，晾干后在倒置显微镜下观察。
2.3 染色法测定培养液中的游离脂肪酸 将 HepG2 细胞以每孔 5×104 个细胞接种于 24 孔培养板内， ℃、 37 5%CO2 及饱和湿度条件下培养待细胞长至 80%满时，吸弃培养液，将 实验组分为 1%血清的 DMEM 培养液空白对照组（无细胞） 正常细胞对 ，照组（含 1%血清的 DMEM 培养液） CLA 干预组(浓度为 0、10、50、100 、mmol·L-1)，每组设 3 孔并列，孵箱中培养 24 小时后吸弃培养液， CLA 干预组每孔加入 1ml 100nmol·L-1 的胰岛素溶液作用 1 小时后， 按照试剂盒说明书方法， 用比色法测定培养液中游离脂肪酸的变化， 采同时 24 孔板内细胞胰酶消化后细胞计数板计数 2.4 胞总 RNA 的提取 用 TRIZOL 试剂按操作说明书提取，提取的 RNA 用约 25mL DEPC 处理水溶解 2.5 RNA 纯度鉴定 取 RNA5mL，稀释 100 倍后用紫外分光光度计测定其 OD260 和 OD280 值，并计算 OD260/OD280 值及 RNA 浓度。