wordCu胁迫对玉米渗透调节物质与色素含量的影响某某：曹晓冰 学号：200840810201指导教师：X瑞娥摘要：［目的］通过采用盆栽试验方法，研究不同Cu浓度对玉米叶片渗透调节物质与色素含量的影响［结果分析］实验结果明确：随着铜浓度的增加,复原性糖的含量是先增加后下降的；蛋白质的含量先是有所下降后呈上升趋势；脯氨酸含量和类胡萝卜素含量呈现上升趋势；其中叶绿素含量呈先升高后逐渐下降趋势关键词：玉米 Cu胁迫 渗透调节物质 色素含量玉米〔Zea maysL〕属于单子叶植物，属于禾本科(Poaceae〕玉蜀黍族〔Maydeae〕一年生谷类植物，植株高大，茎强壮，挺直叶窄而大，边缘波状，于茎的两侧互生就玉米利用而言，大体经历了作为人类口粮、牲畜饲料和工业生产原料的三个阶段，口粮消费占玉米总消费的比重大约在5%左右，但是随着时代的开展，这个比例有逐步上升的趋势玉米是三大粮食品种之一，为解决人类的温饱问题起到很大作用并且玉米种子较容易培养，质量好的种子生活力强，成长后植株健壮，出苗整齐，发芽势和发芽率都较高，所以在培养时要选用籽粒饱满，颗粒较大的种子有发芽能力的种子，在水分、温度和氧气三个条件都满足其需要时，休眠的种子就开始发芽，所以恒温培养过程中要注意水分的变化情况，与时补充水分。
玉米的取材方便，并且培养条件便于控制，所以玉米的研究意义变得更加重大植物的生长需要无机物的供给，主要表现在对于大量元素和微量元素的吸收，植物根系对环境中不同阴离子和阳离子的吸收速度不同会改变环境的酸碱度，影响植物的生长其中微量元素铜是各种氧化酶活性的核心元素，是植物体内多酚氧化酶、氨基氧化酶、酪氨酸酶、细胞色素氧化酶等组分的重要成分，与这些酶的电子承受与传递有关［1］一般禾本科植物对铜元素很敏感，适量的铜溶液对植物生长是必要的，玉米植株的正常培养液铜浓度为0.32umol/L当土壤缺铜时植物分蘖数量多但不抽穗，子粒不饱满，叶片失绿，牧草出现白瘟病一样的缺铜症状但是过量的铜元素对生长发育产生危害，过量的铜抑制脱羧酶的活性，主要是妨碍植物对二价铁的吸收和在体内造成NH4+的累积，间接阻碍了NH4+向谷氨酸转化运转植物体首先接触铜离子的为根部，在低浓度下根部能够有选择的吸收无机离子缓解其对于植物体的影响，高浓度的铜溶液会使根尖硬化，使根部受到严重损伤，生长点细胞分裂受到抑制，根毛少甚至枯死［2］在玉米幼苗培养过程中,用不同浓度的Cu2+溶液来培养植株，胁迫植株生长，观察植物叶的生长变化，测定其生理指标，了解它对于植物渗透调节物质的影响，主要包括脯氨酸的含量，复原性糖的含量，蛋白质的含量以与叶绿体色素含量。
随着工业的开展，铜污染现象变得比拟普遍，环境中过量的铜却会对植物产生伤害,铜污染物可通过对植物光合色素的破坏或抑制其合成从而影响光合作用;铜进入细胞后能直接或间接启动膜质的过氧化作用,导致膜的损伤和破坏;同时能改变植物体内抗氧化酶系统的活性［3］因此，对于Cu污染影响的调查和研究已经越来越被人们重视，本实验重点以X单958品种玉米为材料，研究不同浓度的铜溶液对玉米渗透调节物质的影响,揭示玉米对铜胁迫的响应1.材料与方法实验材料X单958品种的玉米种子，产自某某试验材料初期处理选种：选取X单958品种玉米种子籽粒饱满，大小一样且较大的玉米种子消毒：称取2gK2MnO4,用蒸馏水溶解，后用500mL容量瓶定容2次，制成2g/L的K2MnO4溶液经选取好的玉米种子放入大烧杯中浸种，用K2MnO4溶液浸泡15分钟清洗：浸泡过的种子先用清水洗净，直至清洗液红色退去浸种：冲洗几次溶液变成无色后参加蒸馏水放入恒温培养箱中30℃条件下8小时)播种：在30个花盆中放入等量用蒸馏水湿润后的蛭石，将处理过的一样数量种子放在蛭石上，在播种的过程中要注意将种子之间的间距调整好，尽量的保持一致；并且要将种子的胚方向一致，使幼苗从一样的方向生长，最后加盖一层枯燥的蛭石，放入光照培养箱中培养。
间苗：待玉米幼苗长出后，保存生长状况相似，生长较好的植株，将长势较弱，分布不均匀的幼苗拔除，使植株之间的距离变得疏松，间距均匀幼苗培养：将光照培养箱的时间设置成两个时间段，一段25℃，另一段20℃，4级光照条件下连续培养3个循环直到有幼苗长出待幼苗长出后将培养箱设成两个时间段，25℃时14小时光照，20℃时10小时黑暗处理，连续培养14天隔3天浇一次水，约50mL，观察幼苗生长情况培养液配置以Hoagland培养液为根本培养液〔配方见表1〕，试验组分别以CuSO4·5H2O〔分析纯〕配制不同浓度的铜培养液代替根本配养液中的铜溶液对照组设定为Hoagland完全培养液(完全培养液中铜浓度为：2umol/L)，实验组是铜浓度分别为：1umol/L，10umol/L,100umol/L，1000umol/L，5000umol/L，10000umol/L的溶液表1Hoagland 培养液药品名称用量〔g/L〕大量元素Ca(NO3)2KNO3MgSO4·7H2OKH2PO4FeFeSO4·7H2O7.45×10-3Na2-EDTA5.57×10-3微量元素H3BO32.86×10-3MnSO41.015×10-3H2MoO49×10-5CuSO4·5H2O7.9×10-5ZnSO4·7H2O2.2×10-4材料处理待材料第三片新叶长出后将植株分成四组，每组包括七盆：对照组和实验组。
对照组用标准的Cu2+完全培养液处理，实验组中的六盆分别用不同浓度的Cu溶液(1umol/L,10umol/L,100umol/L,1000umol/L,5000umol/L,10000umol/L〕处理，第一次每个花盆浇250mL的培养液,后几次每个花盆浇125mL,连续处理12天后观察叶片生长状况，等叶片出现症状稳定后就可以开始测植物叶的渗透调节物质的含量指标测定可溶性性糖的测定方法采用蒽酮比色法来测定糖含量［4］g,共三份分别放入三支试管中，在每支试管中参加5mL的蒸馏水后加上试管塞，再用封口膜封住试管口，放入沸水中提取30min将提取液转入25mL的容量瓶中再参加5mL的蒸馏水煮沸30min,再将提取液转入25mL容量瓶中，最后用蒸馏水定容到25mL吸取样品提取液在620nm波长下测吸光值每种浓度的幼苗进展三次平行试验，取平均值根据标准曲线可以求出标注曲线中可溶性糖的含量，再根据可溶性糖的含量〔ug/g)=〔X·V总体积〕/(m·V测定)，计算出材料中可溶性糖的含量标准曲线制作：〔1〕1%蔗糖标准液 将分析纯蔗糖准确秤取1g，参加少量水，转入100mLmL浓硫酸，用蒸馏水定容。
〔2〕100ug/L蔗糖标准液 准确吸收1%蔗糖标准液1mL参加100mL的容量瓶中，加水至刻度取20mLmL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸；充分震荡，立即将试管放入沸水浴中，试管均准确保温1min,取出后自然冷却至室温，以空白作参照，在630nm波长下测其吸光值，以蔗糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，并可求得标准线性曲线：yx表2 蒽酮法测可溶性糖标准曲线试剂量试剂管号01、23、45、67、89、10100ug/L蔗糖/mL0水/mL蔗糖量/ug020406080100脯氨酸的测定方法用酸性茚三酮法和比色法测定脯氨酸的含量［5］g放入试管中并参加3%的磺基水杨酸5mL在沸水中提取10min，冷却后过滤到干净的试管中，即为脯氨酸的提取液吸取2mL提取液于另一干净试管中，参加2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮，在水浴中加热30min,溶液即呈现出红色，冷却后参加4mL甲苯，吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯，以甲苯作对照，在520nm波长下测吸光值根据所求的吸光值随脯氨酸浓度而变的回归方程可以求出标准曲线中脯氨酸的含量，在根据脯氨酸含量〔ug/g〕=(X·V总体积)/(m·V测定)，可以计算出被测材料中脯氨酸的含量。
标准曲线制作:〔1〕配制浓度为10ug/mL的标准脯氨酸溶液〔2〕取6个50mLmLmLmLmLmLmL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为：1ug/mL、2ug/mL、3ug/mL、4ug/mL、5ug/mL与6ug/mL蛋白质的测定方法采用参考文献［6］g放入研钵中，参加2mL蒸馏水研磨成匀浆，再用6mL的蒸馏水分两次冲洗研钵，将研钵内残留的液体全部冲洗干净，后将洗涤液收集于同一离心管中，在室温条件下放置1h充分提取，然后在4000r/min离心20min,将上清液转入10mL容量瓶中定容，即得待测液提取液吸取样品蛋白质提取液1mL，参加5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后以空白〔1mL水+5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂〕为对照，在595nm波长下比色测定光密度OD595算出标准曲线中蛋白的含量之后再根据公式:蛋白质含量〔mg/g〕=〔X·V总体积〕/(m·V测定)，最终可以求出材料中蛋白质的含量标准曲线制作:0～100ug/mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表2取样盖塞盖后将各试管溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光径的比色杯在595nm波长下比色，记录各试管测定的OD595nm光密度值，计算出回归方程：yx表3 考马斯亮蓝G-250法如此测蛋白质含量标准曲线的制作管号123456100ug/mL标准蛋白溶液/mL0蒸馏水/mL0考马斯亮蓝G-250试剂/mL蛋白质含量/mL020406080100叶绿体色素的测定方法叶绿素含量采用80%丙酮提取和分光光度法测定[7]g，放入研钵中，参加少许碳酸钙、石英砂与纯丙酮5mL，研磨成匀浆，在参加80%的丙酮5mL，继续研磨直至组织变白，静置5min。
将匀浆转入离心管中，并用适量80%的丙酮洗涤研钵，一并转入离心管中，离心后弃去沉淀，上清液用80%的丙酮定容至20mL吸取叶绿体提取液1mL加80%丙酮4mL稀释后转入比色杯中，以80%丙酮作为空白对照，在波长为665nm、645nm、470nm下测吸光值做三组平行试验，所得数据取平均值计算公式为：Ca=12.7·A663-2.69·A645Cb=22.9·A645-4.68·A663C总叶绿素=8.02·A663+20.21·A645C类胡萝卜素=〔1000·A470-3.27·Ca-104·Cb)/229根据所得公式，结合数据可以求得所测材料的叶绿素含量和类胡萝卜素的含量，最后取平均值，绘制成图2.指标测定与分析铜胁迫对玉米可溶性糖含量的影响图1 铜胁迫对糖的含量的影响02000400060008000CK1101001000500010000Cu溶液的浓度〔umol/L〕糖的含量〔ug/g〕由图中1可以看到铜胁迫对玉米幼苗复原性糖的影响，在铜溶液的浓度为10umol/L时糖的含量比1umol/L时上升近1.5倍，比铜溶液为1umol/L时增加0.047%，但在铜浓度增加为100umol/L时可溶性糖的含量下降了0.57%，在1000umol/L时有微量的下降，下降量为0.082%，后来随着铜浓度的进一步增加，可溶性糖的含量呈现出下降趋势，下降量为0.075%和0.037%。
原因是低浓度铜溶液的胁迫条件下渗透调节物质。