目录摘 要 1..引言 1...1.材料与方法 4...1.1实验材料 4...菌株 4...体质粒载 4..酶和试剂 4..酶 4..抗生素 5..生化试剂 5..1.2仪器设备 5...1.3实验方法 5...酶切 5...片段补平 6..大片段去磷酸化 乙醇沉淀纯化 DNA 7..胶回收 7..连接 高保真酶 PCR 反应 检测PCR反应 8.技术 反应 7.1 . 3 . 1 0大肠杆菌转化 质粒提取 9..2. 结果与分析 1..2.2.1pWBVec8+Ga-b载体的酶切 1.22.2载体去磷酸化 1..22.3载体补平 1..2.2.4Cas9质粒的酶切 132.5含有Cas9元件片段的补平 132.6Cas9元件片段与载体的连接 1.32.7pWBVec8+Ga-b-CRISPR质粒检测 1 32.8入门载体的构建 1..43. 讨论 1..5.参考文献 1..7.致谢 1..8..集胞藻 6803 基因的克隆及植物转化载体的构建摘 要：关键词 ：Gateway 技术Key words: Gateway technology引言蓝藻是地球上最原始、最古老的一群植物，分布很广，主要生活在 淡水中，海水中也有。
蓝藻它是在地球上几乎还是绝对无氧的还原环境 下，第一个利用太阳能将二氧化碳制造成有机物并释放出游离氧气的先 驱生物，它对地球上的其他自养生物和异养生物的产生和演化，乃至人 类的起源有着无可替代的重大意义蓝藻藻体有单细胞体、群体和少数 丝状体，为原核生物，细胞壁在电镜下分为四层，原生质体由中心质和 周质组成，中心质含有 DNA ，无核仁和核膜结构，称为原核周质中有 很多扁平膜状的光合作用片层，呈条状有规律的排列，分布在其表面的 色素有叶绿素a、藻蓝蛋白、藻红蛋白及一些黄色色素蓝藻的光合作用 产物为蓝藻淀粉和蓝藻颗粒体周质中还有气泡 蓝藻约有 150 属， 1500 种，分布很广，从两极到赤道，从高山到海洋，到处都有它们的踪 迹根据其植物体的形态不同而分为三个纲： 1、色球藻纲：包括所有单细胞体和单细胞群体种类 2、藻殖段纲：包括所有不分枝或假分枝丝 状体种类及丝状群体种类3、真枝藻纲：包括所有具真分枝的丝状体种类基因组编辑就是指定点改造基因组，得到预期的生物体基因组序列 从而发生遗传改变的技术，主要是进行 DNA 序列的敲除、插入、定点突 变和组合编辑等，从而实现基因功能与调控元件的系统研究 ［1］。
从基因组的角度出发对植物基因进行人工改造从而培育优良品种具有非常重要的 意义由于外源 DNA 与基因组靶基因发生同源重组效率很低，因此对 植物基因组进行人工改造就显得异常困难近年来，人们借用人工改造 核酸酶来提高同源重组的效率，从而实现了对基因组的精确、定向的人 工改造目前应用于基因组编辑主要包括巨核酶技术 (Meganucleases、) 锌指核酸酶 (ZFN) 、以及 TALEN 核酸酶，它们已在植物基因工程中已经得 到了成功的应用然而传统基因组编辑技术存在明显不足，例如， ZFN 和 TALEN 对于每一个新的 ZFN 或 TALEN 嵌合蛋白质都需要被改造才能 识别靶序列，这就使两种基因组编辑系统广泛应用受阻然而最近发现 的 CRISPR 系统介导的基因组编辑技术只需要一小段引导 RNA 就能够识 别特定的 DNA ［2］而且一个新的位点只需要一个新的引导 RNA ，极大的 简化了基因组编辑的过程，扩大了靶位点的选择 CRISPR 系统也可以应 用于靶向基因突变和基因修正，并且该系统也容易设计，可以实现大片 段 DNA 缺失以及用于复合基因编辑CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats- CRISPR-associated protei ns系统是细菌与古生菌中用来抵御外源病毒或质 粒DNA入侵的获得性免疫系统。
对于一个典型的 CRISPR位点而言通 常包含若干长度为20-50bp的保守性的正向重复序列和被其间隔开的短的 非重复序列，以及位于重复上游的引导序列［3］CRISPR系统存在三种类 型，尤其以2型CRISPR系统研究较多，在2型CRISPR系统中存在 Cas9核酸酶，又称 CRISPR/Cas9系统Cas9核酸酶具有改造crRNA和 破坏双链DNA的双重功能⑺位于sgRNA5端的20个左右的碱基决定 CRISPR/Cas9系统在应用时Cas9核酸酶特异性切割的部位，主要负责决 定CRISPR/Cas9系统的特异性，因此，只要改变这段引导 RNA序列即可使Cas9定位到新的DNA序列上，如果同时引用多个引导 RNA也可同时 进行基因组上多个不同位点的编辑，从而实现复合基因的编辑CRISPR/Cas9系统介导的植物基因的定点突变原理为：首先， Cas9蛋 白与sgRNA形成复合体其次，上述复合体切割与 sgRNA的spacer互 补的基因组 DNA 序列，随后造成双链 DNA 的损伤最后通过体内的 NHEJ或HR修复机制将引入基因突变 ⑷受序列的限制以往的CRISPR载体往往是两个载体，也即表达 sgRNA和Cas9元件位于不同的载体，共转化效率较低，为了克服这一困 难，我们采用酶切连接和 Gateway技术构建便式表达载体。
我们已经了 解sgRNA 5端的20个左右的碱基决定CRISPR/Cas9系统的特异性，但是 20个左右的碱基片段链接不方便，使用起来操作不方便效率偏低本研 究利用Gateway技术和改进后的定点突变技术将基因特异的靶序列构建 到通用载体中得到表达特异基因 sgRNA 的入门载体，将其与目标载体同 源重组即可得到特异的基因表达载体1. 材料与方法1.1 实验材料菌株大肠杆菌 DB3.1 和 Trans1-T1 感受态细胞均有周口师范学院植物遗传 与分子育种重点实验室提供质粒载体入门载体： pDONR207 周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提 供表达载体：周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供酶和试剂酶KOD plus DNA 聚合酶(Toyobo)T4 DNA 连接酶(New England Biolabs) 热敏磷酸化酶 (New England Biolabs)抗生素Gentamycin(Sigma)Spectinomycin(Sigma)实验试剂琼 脂 、 TAE 缓 冲 液 、 Goldwiew 试 剂 、 6x 上 样 缓 冲 液 (loadingbuffer )、DNA分子大小标准参照物、无水乙醇、 75%乙醇、异丙醇、 75%甘油、蒸馏水、 LB 培养基各组成成分、高纯度质粒小量快 速提取试剂盒购自艾德莱生物科技公司。
1.2 仪器设备普通 PCR 仪、超净工作台、精密电子天平、 100mL 的容量瓶、培养 皿、移液枪、-20 C冰箱、-70C冰箱、37C摇床、37 T培养箱、恒温水浴 锅、电泳仪、制胶板、一次性手套、微波炉、水平电泳槽、凝胶成像分 析系统、离心机等1.3 实验方法集胞藻基因组的提取本次实验进行 KODPCR 扩增所需的模板 (目的基因 )为集胞藻的整个 基因组，提取的方法为周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室人 员自己探索的方法，先将集胞藻离心收集于离心管中，加入提取液、溶 菌酶、 0.2mm 的玻璃珠后，轻轻震荡破碎集胞藻细胞，然后纯化 DNA，即得到集胞藻的整个基因组集胞藻 6803CCM 途径基因的 KODPCR 扩增KODPCR反应体系：总体系为50卩1均为周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室购买，呈干粉状态，先经过高速离心，再稀释100倍KODPCR的温度设置：先经过95C预变性8分钟，然后是95C变性30s, 58C退火30s,72C延伸1min，进行35个循环后，再经过 72C终变性5min, 16C保 存，即完成整个循环琼脂糖凝胶电泳琼脂糖0.2gTAE缓冲液20mLGold wiew0.6 卩1⑴准备。
本实验需制备1%的琼脂糖胶液，称取 0.2g琼脂糖溶于 20mL的电泳缓冲液TAE中2) 熔解微波炉加热使琼脂糖充分熔解3) 加入Goldwiew由于溴化乙锭毒性较大，故本实验加入核酸染 色剂Goldwiew，需戴上一次性手套4) 灌胶 本实验选择的是小型制胶板，缓慢地将琼脂糖胶液注入 1个带有“梳子”的胶床中，至胶完全凝固，约 20 分钟左右5) 放胶 代胶凝固之后，轻轻拔出梳子，将制胶板放在电泳槽内， 加样孔一侧靠近阴极 (黑色电极 )，注入适量的电泳缓冲液6) 点样 取适量KODPCR扩增产物及DNA分子大小标准参照物， 加入 6x 上样缓冲液，混匀，采用移液器进行点样：使吸管与加样孔垂直，吸管尖端刚好在加样孔开口之下，缓慢将 DNA羊品加入加样孔中7) 电泳 加样完毕后，正确连接电泳槽和电源，黑色连阴极，红色 连阳极，电压为130V，电流为135mA8) 拍照、保存 跑胶 30min 后，切断电源，取出凝胶，用凝胶成像 分析系统拍照保存产物纯化：硅胶膜吸附法缓冲液 EB 需事先预热吸附柱先加入平衡液进行平衡(1) 300卩溶胶液、100卩异丙醇与PCR产物混合(2) 混合液转移至吸附柱，室温放置 1min， 3000 rpm 1min ， 12000rpm 1min(3) 将吸附柱内下层液体倒掉，加入 600 ^WB (洗脱液)，12000 rpm 1min(4) 重复 3。
5) 将洗脱液倒掉以后， 12000 rpm 2min(6) 把吸附柱放入新的1.5EP管，加入50卩缓冲液EB, 37C烘箱放置 5min， 12000 rpm 1min技术反应以构建入门载体目的，5.2卩反应体系，配比如下，25C,水浴1-3h 转化普通大肠杆菌Trans-5阿尔法感受态细胞PCR纯化产物 4卩1PDONR207 0.7 卩1BP重组酶 0.5卩11.3.6 Trans-5阿尔法感受态大肠杆菌转化(1) -80C冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，将溶未溶时转化效率最后 ⑵加入BP反应产物，10卩混匀，冰浴30min3) 将感受态细胞在42 C水浴锅中热激90s,此过程要迅速4) 取出后迅速转移到冰山，冷却 2min5) 无菌条件下，感受态中加入 50 ylLB培养液(不含抗生素)混匀后于37C 恒温箱 150 rPm 摇床 45min6) 在无菌条件下，均匀涂到含有 Gen 抗生素的 LB 固体培养基上，待平 板上的菌液完全吸收后，倒置平板 37 E培养过夜7) 挑单克隆挑取大肠杆菌 8处单菌落于8个50mL离心管中，加入LB 培养液8) 37r恒温箱150 rpm摇床3h。
1.3.7 菌液 PCR 反应验证入门载体是否转到大肠杆菌内，PCR反应体系(15卩)12>Mix 7.5 卩1Primer1 0.5 卩1Primer2 0.5 卩1菌液 1 IddH2O 5.5 ilPCR反应的条件：95T预变性 8min, 95C变性 30s, 58T退火30s, 72E延伸1min,扩增35个循环，72E终变性5min, 16°C保存琼脂糖凝胶电泳过程同 保菌75%的甘油与菌液。