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植物组织培养基配制.doc

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植物组织培养基配制.doc_第1页
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培养基的配制植物组织培养中常用的一种培养基是MS培养基MS培养基的配制包括以下步骤培养基母液的配制和保存 MS培养基含有近30种营养成分,为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量,可将培养基中的各种成分,按原量的20倍或200倍分别称量,配成浓缩液,这种浓缩液叫做培养基母液这样每次使用时,取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL),加水稀释,制成培养液现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出,供配制时使用大量元素(母液Ⅰ)         mg/LNH4NO3                      33 000KNO3                        38 000CaCl2·2H2O              8 800MgSO4·7H2O              7 400KH2PO4                      3 400微量元素(母液Ⅱ)KI                       166H3BO3                       1 240MnSO4·4H2O               4 460ZnSO4·7H2O               1 720Na2MoO4·2H2O            50CuSO4·5H2O              5CoCl2·6H2O              5铁盐(母液Ⅲ)FeSO4·7H2O              5 560Na2-EDTA·2H2O           7 460有机成分(母液Ⅳ)ⅣA肌醇                      20 000ⅣB烟酸                       100盐酸吡哆醇(维生素B6)        100盐酸硫胺素(维生素B1)        100甘氨酸                     400以上各种营养成分的用量,除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外,其余的均为200倍浓缩液。

上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液其中,母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是:每种母液中的几种成分称量完毕后,分别用少量的蒸馏水彻底溶解,然后再将它们混溶,最后定容到1 L母液Ⅲ的配制方法是:将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中,边加热边不断搅拌使它们溶解,然后将两种溶液混合,并将pH调至5.5,最后定容到1 L,保存在棕色玻璃瓶中各种母液配完后,分别用玻璃瓶贮存,并且贴上标签,注明母液号、配制倍数、日期等,保存在冰箱的冷藏室中MS培养基中还需要加入2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、6 苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质,并且分别配成母液(0.1 mg/mL)其配制方法是:分别称取这3种物质各10 mg,将2,4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶,将6BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解,溶解过程需要水浴加热,最后分别定容至100 mL,即得质量浓度为0.1 mg/mL的母液配制培养液 用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量:母液Ⅰ为50 mL,母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。

再取2,4-D 5 mL、NAA 1 mL,与各种母液一起放入烧杯中配制培养液时应注意:①在使用提前配制的母液时,应在量取各种母液之前,轻轻摇动盛放母液的瓶子,如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染,应立即淘汰这种母液,重新进行配制;②用量筒或移液管量取培养基母液之前,必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次;③量取母液时,最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上,量取1种,划掉1种,以免出错溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂9 g、蒸糖30 g,放入1 000 mL的搪瓷量杯中,再加入蒸馏水750 mL,用电炉加热,边加热边用玻璃棒搅拌,直到液体呈半透明状然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中,最后加蒸馏水定容至1 000 mL,搅拌均匀需要注意的是,在加热琼脂、制备培养基的过程中,操作者千万不能离开,否则沸腾的琼脂外溢,就需要重新称量、制备此外,如果没有搪瓷量杯,可用大烧杯代替但要注意大烧杯底的外表面不能沾水,否则加热时烧杯容易炸裂,使溶液外溢,造成烫伤调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液,逐滴滴入溶化的培养基中,边滴边搅拌,并随时用精密的pH试纸(5 4~7 0)测培养基的pH,一直到培养基的pH为5 8为止(培养基的pH必须严格控制在5 8)。

培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装分装时,先将培养基倒入烧杯中,然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 mL或100 mL)中注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5~1/4每1 000 mL培养基,可分装25~30瓶培养基分装完毕后,应及时封盖瓶口用2块硫酸纸(每块大小约为9 cm×9 cm)中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口,并用线绳捆扎最后在锥形瓶外壁贴上标签高压灭菌 培养基的高压灭菌包括以下几个步骤第一,码放锥形瓶将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中,再放入高压蒸气灭菌锅内如果没有金属小筐,可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开第二,放置其他需要灭菌的物品将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内,如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶(以上物品都要用牛皮纸封口),用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等第三,灭菌待需要灭菌的物品码放完毕,盖上锅盖在98 kPa、121.3 ℃下,灭菌20 min灭菌后取出锥形瓶,让其中的培养基自然冷却凝固最好放置1 d后再使用MS培养基配方:                                                成分               分子量           使用浓度(mg/L)硝酸钾 KNO3           101.11           1900硝酸铵 NH4NO3         80.04            1650大量元素          磷酸二氢钾  KH2PO4      136.09           170硫酸镁 MgSO4.7H2O      246.47           370 氯化钙 CaCl2.2H2O      147.02           440碘化钾 KI              166.01            0.83       硼酸 H3BO3            61.83             6.2硫酸锰 MnSO4.4H2O      223.01            22.3微量元素           硫酸锌 ZnSO4.7 H2O      287.54             8.6钼酸钠 Na2MoO4.2 H2O    241.95            0.25硫酸铜 CuSO4.5 H2O       249.68            0.025氯化钴 CoCl2.62        237.93            0.025 铁盐              乙二胺四乙酸二钠 Na2.EDTA     372.25           37.3硫酸亚铁 FeSO24.7H2O       278.03           27.8  肌醇                                100 甘氨酸                                2有机成分            盐酸硫胺素 VB1                        0.1盐酸吡哆醇 VB6                        0.5烟酸 VB5或VPP                       0.5蔗糖 sucrose            342.31          30g/LB5培养基的组成和配方组成成分                    数量(mg/l) KNO3                        2500 大量元素                 CaCl2·2H2O                  150 MgSO4·7H2O                  250 (NH4)2SO4                     134KI                         0.75H3BO4                        3.0MnSO4·4H2O                   10 微量元素               ZnSO4·7H2O                   2.0 Na2MoO4·2H2O                0.25 CoCl2·6H2O                 0.025 CuSO4·5H2O                 0.025铁盐                Na2-EDTA                      37.3 FeSO4·7H2O                      27.8  肌醇                              100烟酸                               1.0 有机成分            盐酸吡哆醇                         1.0 盐酸硫铵                           10       N6培养基配方组成成分                    数量(mg/l)硝酸钾(KN03)                 2830硫酸铵(NH4SO4)                 463大量元素               氯化钙(CaCl2·2HzO)            166硫酸镁(MgSO4·7H20)             185磷酸二氢钾(KH2PO4)             400硫酸亚铁(FeSO4·7H20)          27.8硫酸锰(MnS04·4H20)             4.4微量元素             硫酸锌(ZnSO4·7H20)             1.6硼酸(H2BO3)                   0.8碘化钾(KI)                     1.6 甘氨酸                         2  有机成分                 烟酸                         0.5盐酸硫胺素(维B1)                1.0盐酸吡哆素(维B6)本发明涉及一种适宜蓝莓试管苗增殖的培养基组合物及其方法,步骤如下:1)培养基包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为:(1)基本培养基:WPM,其中白糖30g/L,琼脂7~8g/L,pH5.3;(2)诱导培养基:WPM+TDZ1.0~2.0mg/L+IBA0.3~0.5mg/L;(3)叶片诱导。

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