植物细胞培养生产次生代谢产物的研究进展 08生物科学 081003011 余芸摘要： 利用植物细胞培养生产代谢产物具有十分广阔的前景对利用植物细胞培养技术生产次生代谢产物的条件控制、生产方法和在制药工业上的应用进行了综述,并对该技术的发展趋势进行了展望关键字：植物细胞培养 次生代谢产物 工业应用植物细胞培养始于本世纪初，并不可争议地具有工业化潜力目前植物细胞培养生产的化合物很多，包括糖类、酚类、脂类、蛋白质、核酸以及帖类和生物碱等初生和次生代谢产物，植物细胞培养的应用主要包括以下3个方面：有用物质（次生代谢产物）的生产；植物无性系的快速繁殖和遗传突变体的筛选；植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的深入研究但是由于植物细胞大规模培养技术的局限性使得植物细胞仍难以实现大规模工业化生产，迫切需要进一步研究和发展细胞培养条件的优化控制及其工艺1 植物细胞培养技术生产次生代谢产物的研究历史及现状植物次生代谢的概念是在1891年南KOSS—ZEL首先明确提出的[1]植物细胞培养技术源于德国著名植物学家HABERLANDT(1902)提出的细胞全能性学说。
植物细胞具备生物合成的全能性，即每个培养细胞保留着完整的遗传信息，能生产所有母体植物中合成的化学物质1．1植物细胞培养技术特点与其它的方法相比，应用植物细胞培养技术生产次生代谢产物爨有以下优点：(1)能够保证产物在一个限定的生产系统中连续、均匀生产，不受病虫害、地理和季节等各种环境因素的影响；(2)可以在生物反应器中进行大规模培养，并通过控制环境条件得到超过整株植物产量的代谢产物；(3)所获得的产物可从培养体系内直接提取，并快速、高效的回收与利用，简化了分离与纯化的步骤；(4)有利于细胞筛选、生物转化，合成新的有效成分[2]5)有利于研究植物的代谢途径，还可以利用某些基因工程手段探索与创造薪的合成路线，得到价值更高的产品；(6)节省大量用于种植原料的农田，以便进行粮食作物的生产1．2植物细胞培养技术研究历史与现状1956年ROUTIOR秘NIKZELL首次提出应用植物细胞培养技术商业化生产植物化合物的设想，1967年KAUL和STABA采用多并发酵罐对Ammivisnaga进行了细胞大量培养的研究，并首次用此方法得到了药用成分呋哺色酮，使这一设想变为现实[3]但是，由于植物细胞培养体系中细胞生长缓慢，目标代谢产物极低(通常不到细胞于重的1％)[4]等特点，再加上植物细胞所特有的生理生化特性还没被人们所认识，人们单纯的模拟培养微生物的条件来培养植物细胞及当时有效成分的分析手段落后等原因，人们并没有看到该技术在生产天然产物方面的潜能。
20世纪70年代以后，该技术有所发展，利用植物细胞工程技术生产一些药用有效成分在工业上获得成功，据20世纪80年代末期的统计，当时全世界有40多种植物的细胞培养工程研究获得成功，部分悬浮细胞培养体系中次生物质的产量达到或超过整体植株的产量，有些药用植物的研究达到中试水平，其中利用紫草悬浮细胞培养生产紫草宁的成功令人瞩目[5]1984年日本的Mitsui公司利用紫草生产紫草宁规模达到750 L，产物最终浓度达到1400 mg／L20世纪90年代至今，利用植物细胞进行天然产物的生产进入了一个崭新的发展阶段，它与基因工程、快速繁殖形成了新世纪生物技术领域的三大主流[6]迄今为止，全世界已经有1 000多种植物进行过细胞培养的研究利用植物细胞培养技术生产的次生代谢产物被人类广泛应用，一些天然成分如紫杉醇、紫草宁、迷迭香酸和人参皂甙等已进入工业化生产阶段同时探索出了悬浮培养、两相培养、固定化培养、毛状根培养、冠瘿培养、反义技术等先进的培养方法据1996年报道，国际上通过植物细胞和组织培养的方法进行食品成分商业纯生产最成功者是日本下面列出几个利用植物培养技术工业化生产有用代谢物的例子，如紫杉醇的生产，自从1991年CHRISTEN等人申请有关红豆杉组织培养的专利以来，在培养体系紫杉醇含量已提高100多倍，达到153 mg／L，美国的Phytoncatalytic公司已在德国进行了75 t发酵罐的试验；其他如日本三井石油公司生产紫草宁和小檗碱(750 L)、日本日东电工公司生产人参皂甙和花色素(500L)、西德A．Nattermann&Gie．GmbH公司生产迷迭香酸(75 000 L)、英国的辣椒素生产、美国的香子兰代谢物生产、加拿大的血根碱生产等[7]。
植物细胞培养进行有效成分的生产发展到现在，已经取得令人瞩目的成就然而在植物细胞培养过程中普遍存在的细胞系不稳定、细胞生长缓慢、不耐剪切力及代谢物产量低等问题又成为其实现规模化生产的瓶颈在目前已经研究过的植物中，仅有1／5左右种类的培养物中目的产物的含量接近或超过原植物，多数情况下培养合成某些次生代谢物的能力下降甚至消失[8]因此充分利用基因工程的手段，筛选高产细胞系，深入研究特定代谢产物的生物合成途径，对培养条件进行优化，研究和开发适合植物细胞培养的生物反应器是解决这些问题的根本途径2生产次生代谢产物的条件调控2.1高表达细胞系的选择筛选高产而稳定的细胞系,可以大大增加次生代谢产物的产量和质量. 目前,使用转基因技术中的稳定表达系统和瞬时表达系统[9 ] ,生产出带有目的基因的高产细胞系,然后进行大量筛选,可获得能生产特定次生代谢产物的目的细胞系转基因技术生产细胞系目的投资小,成本低,使用安全,植物细胞的培养条件简单,易于成活,便于进行遗传操作 经转化后的目的细胞系易于储藏,方便生产 杨振泉等通过选择和改造启动子、改造和优化目的基因、进行合适的亚细胞定位,增加了目的细胞系获得的概率[ 10] 。
转基因技术获得目的细胞系的主要方法有:土壤农杆菌介导转化法、重组病毒感染植株、基因枪转化法和花粉管通道转化法[ 11 ] . 细胞工程技术与分子生物学技术结合后,人工可设计出目的基因,使其控制细胞系的某些特定的生理性状,再进行筛选,这将引起细胞培养技术的新突破2.2合适的环境条件光照对次生代谢产物的合成有重要影响. 不同植物细胞生产次生代谢产物时,对光质和光量的要求是不同的,如玫瑰茄悬浮细胞合成花青素时,蓝光是促进玫瑰茄细胞产生花青素的最有效单色光,产量为416 mg/ L ,和全色光差不多,红光和橙光无效,其他单色光随其波长接近蓝光,正效应增强[12]植物细胞培养的最适宜p H 值在5～6 之间, 但也存在差异不同种类的植物细胞培养对温度的要求是不同的,最适的温度为25 ℃左右,超过30 ℃,对生长有明显的抑制作用较低的温度有利于生物碱的合成,而高温则会导致次生代谢产物的合成基本停止[13 ] 接种量影响次生代谢产物的有效积累,接种时必须满足一定的接种量在植物细胞生物反应器及其放大的生产类型中,还要考虑通气状况对次生代谢产物生产的影响 国外学者研究发现:利用生物反应器培养长春花细胞生产阿玛碱时,溶解氧在29 %～43 %时,溶解氧与阿玛碱的产量显著相关.激素通常作为诱导和调节愈伤组织生长的重要因素而用于次生代谢产物的生产,当然也有特殊不需激素的情况,如Ri 质粒诱导的毛状根在无激素培养基上培养,可迅速增殖。
2. 3 合适培养基的选用改良的B5 培养基利于愈伤组织的诱导和以后的培养培养基中糖浓度直接影响某些细胞的干重和次生代谢产物的产量,不同植物细胞对培养基成分的需求也各不相同3 植物细胞培养技术应用前景虽然植物细胞大规模培养生产有用次生代谢产物在过去几十年取得了飞速发展，但真正应用于商业化生产的事例不多，就目前的工艺，以低于1 000$／kg的生产成本来获得某种次生代谢物是困难的[14]，况且许多基础理论和工程技术问题有待于进一步研究展望未来，植物细胞培养技术要想实现真正意义的工业化，必须从以下几方面努力：(1)筛选高产细胞系；(2)利用基因工程手段，对次生代谢中的关键酶基因进行修饰和改造，提高次生代谢物的产量；(3)与工程技术相结合，针对不同的培养体系，研制高效的生物反应器系统随着这几方面研究的不断深入，植物细胞培养这种方兴未艾的技术将在生产有价值的植物天然成分方面发挥越来越大的作用参考文献[1]董妍玲，潘学武．植物次生代谢产物简介[J]．生物举通报，2002，37(11):17—19.[2]采关玲，杨谦，高兴喜，等．植物细胞培养中天然植物成分生产在工地上应用[j]．东北林业大学学报，2003，31(5)：78—80．[3]彭志荚．食品生物技术[M]．北京：中国轻工业出版社，1999．[4] GIRI A，DHINGRA V，GIRI C C，et a1．。
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