测序常见问题及其分析1、PCR产物测序时出现重叠峰 问题图1 （模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）图1-1图1-2■ C G 1 : G TTCGG IGGT 6 TT NT- '■ C 7G G & C . S IC I G C CC T ffCLCTC解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE，纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）图2解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段， 将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解 决问题图3（测序引物有碱基缺失）测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所 不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则 从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化2、克隆测序时出现峰形重叠原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质 粒；或是是送测序的菌液污染 解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。
3、样品有杂合/突变位点G C a . T G . T C C C T T C NGTGTGTG A CvMW-bbig.iQE模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的 杂合位点如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位黑占一般都 罩一的峰 形，然后突然在某一彳固位黑占出现重叠峰（如图中箭^所示）解决方法：建议将DNA片段克隆到载体再测序4、polyA/T和C/G cluster导致的套峰和测序信号衰减图4-1图4-3图4-4TCT □ TT TT T T TT <3TTGT
解决办法：反向测序有时能够顺利的通过重复序列区域（但不是一定都能够），通过多次的测 序结果比对，拼接可以得到全序列结果。