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1、植物源农产品中叶黄素、玉米黄质和-隐黄质的测定 高效液相色谱法编制说明一、工作简况，包括任务来源与项目编号、标准主要起草单位、协作单位、主要起草人、简要起草过程1 任务来源本标准是受农业农村部委托制订的农业行业标准，标准编号为LX20552，编制组承担了植物源农产品中叶黄素、玉米黄质和-隐黄质的测定 高效液相色谱法农业行业标准的制定工作。2起草单位本标准的起草单位为农业农村部食物与营养发展研究所。3协作单位 本标准的协作单位为北京市营养源研究所，内蒙古蒙牛乳业集团有限公司，中国合格评定认可委员会，食品行业生产力促进中心，北京市理化分析测试中心，北京市农林科学院蔬菜研究中心。4 主要起草人 主要
2、起草人为崔亚娟，朱大洲，孔凡华，许洪高，屠振华，梁克红，杨春雪，刘玉峰，李东，赵欣，马文丽，宋晓东，杨志刚，李宏，马杰，贾丽，刘光敏，何洪巨。5 简要起草过程编制组根据农业行业标准制修订工作要求，依据GB_T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则和GB/T 20001.4-2001标准编写与规则 第四部分：化学分析方法，参照GB/T 5009.1食品卫生检验方法 理化部分 总则。2019年6月份底完成资料收集、整理工作，并公开征求多方对标准修订的意见，以确定研究方法与技术路线，并在参考国内外文献的基础上，对植物源农产品中叶黄素、玉米黄质和-隐黄质的测定现有的国内
3、外标准方法进行优化。开展方法重现性、灵敏度、检出限、分离度、准确度、线性关系等技术内容的确定研究。2019年11月底完成检验方法的实验摸索研究，起草出标准文本和编制说明初稿。2020年8月成检验方法标准验证工作，形成验证报告。2020年8月，召开专家研讨会，根据专家意见进行修改完善。2020年9月，形成征求意见稿，公开征求各方对标准（草案）意见。二、与我国有关法律法规和其他标准的关系目前，我国现行的-胡萝卜素和-胡萝卜素的测定方法是GB 5009.83-2016 食品安全国家标准 食品中胡萝卜素的测定适用于食品中胡萝卜素的测定，方法适用于植物源农产品中-胡萝卜素和-胡萝卜素的测定，叶黄素、玉米
4、黄质和-隐黄质检测方法有GB 5009.248-2016 食品安全国家标准 食品中叶黄素的测定适用于婴幼儿配方奶粉、乳品、冷冻饮品、米面制品、焙烤食品、果酱、果冻和饮料中叶黄素的液相色谱测定；GB 26405-2011 食品安全国家标准 食品添加剂 叶黄素适用于以万寿菊油树脂为原料，经皂化、提取精制而成的食品添加剂叶黄素的测定；NY/T 2008-2011 万寿菊及其制品中叶黄素的测定 高效液相色谱法适用于万寿菊及其制品中叶黄素的测定；T/CCCMHPIE 1.43-2018 植物提取物 叶黄素油适用于以菊科万寿菊属植物万寿菊的花为原料，经提取精制制得万寿菊提取物，通过皂化、精制、结晶而制成叶
5、黄素，再添加符合食品添加剂质量规格要求的抗氧化剂稳定剂、乳化剂和（或）食用的植物油制成的样品中叶黄素的测定；T/ZZB 0404-2018 食品添加剂 叶黄素适用于以万寿菊油树脂为原料，经皂化、提取精制而成的食品添加剂叶黄素的测定；T/ZZB 0405-2018 复配食品添加剂 叶黄素微粒适用于以万寿菊为原料制备的叶黄素，配以适量的抗氧化剂DL-a-生育酚和载体淀粉等，采用液相超微乳化和淀粉流瞬时成型双层包埋技术工艺制造成的复配食品添加剂叶黄素微粒中叶黄素的测定；DB64/T 1514-2017 枸杞及枸杞籽油中玉米黄质、-胡萝卜素和叶黄素的测定适用于枸杞及枸杞籽油中玉米黄质、-胡萝卜素和叶黄
6、素的测定。目前国内没有植物源农产品中叶黄素、玉米黄质、-隐黄质的标准测定方法，因此精准定量植物源农产品中叶黄素、玉米黄质、-隐黄质的含量，对食品产业的发展及科研院所、检测机构技术支持具有重要的意义。三、国外有关法律、法规和标准情况的说明国外测定叶黄素的方法主要集中在高效液相色谱法，玉米黄质和-隐黄质尚没有标准检测方法。四、标准的制（修）订与起草原则本标准遵循以下原则：测定方法的准确性：严格控制测定方法的准确性和精密度，确保测定结果准确无误。测定方法的检出限：能够满足食品安全监测工作的需要。测定方法的可操作性：便于标准的使用者操作，有良好的重现性。标准的先进性：标准文本的技术水平达到国内同类标准
7、的先进水平，并具有国际水平。五、确定各项技术内容（一） 方法的研制和实验条件的确定1 样品制备的要求将一定数量的样品按要求经过缩分、 粉碎均质后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。2 试样前处理条件的选择和优化2.1 提取溶剂的选择选取以下5种提取溶液：A:正己烷：乙醚：环己烷(V:V:V=2:2:1)混合液；B:石油醚:乙醚(V:V=1:1)混合液；C:乙醇:石油醚(V:V=1:1)混合液；D: 正己烷溶液；E:正己烷、正己烷:乙醚:环己烷(V:V:V=6:1:3)混合液。按以下步骤进行操作：准确称取1.0 g玉米粉于三角瓶中，加入30 mL 含0.1% BHT的乙醇溶液和10 mL 50
8、%氢氧化钾水溶液，混匀。于50恒温水浴摇床150 r/min避光皂化30 min，冷却至室温。将皂化液转入分液漏斗中，分别加入100 mL上述4种不同提取溶液充分萃取，过0.45 m有机系滤膜后用HPLC测定。表1 不同提取溶剂测定结果（n=3）提取溶剂叶黄素含量（g/100g）玉米黄质含量（g/100g）-隐黄质含量（g/100g）正己烷：乙醚：环己烷(2:2:1)混合液826.1129.88485.3120.3355.412.98石油醚:乙醚(1:1)混合液803.6110.97461.288.9146.921.23乙醇:石油醚(1:1)混合液585.5334.70314.2416.164
9、6.512.66正己烷溶液781.5817.35457.801.4854.843.88正己烷:乙醚:环己烷(6:1:3)混合液789.6122.82498.7344.1141.123.34选择不同提取溶液测定叶黄素、玉米黄质和-隐黄质含量如表1所示。结果显示，乙醇:石油醚(1:1)混合液对三种目标物的提取效率均较差，其他几种试剂提取效果没有显著性差异（p0.05），本标准参考GB 5009.248-2016 食品安全国家标准 食品中叶黄素的测定，以正己烷：乙醚：环己烷(2:2:1)混合液作为实验提取溶剂。2.2 皂化反应条件的选择（1）氢氧化钾溶液浓度的筛选：分别加入10 mL 20%、30%
10、和50%氢氧化钾溶液，其他操作步骤同2.1。（2）皂化温度筛选：样品分别在25、50和80恒温水浴摇床150 r/min避光皂化30 min，其他操作步骤同2.1。（3）皂化时间筛选：样品分别避光皂化10 min、30 min、50 min和60min，其他操作步骤同2.1。表2 不同浓度碱溶液皂化测定结果（n=3）碱溶液浓度叶黄素含量（g/100g）玉米黄质含量（g/100g）-隐黄质含量（g/100g）20%氢氧化钾水溶液680.9410.18426.279.1334.862.6030%氢氧化钾水溶液797.9914.82522.616.0051.481.1550%氢氧化钾水溶液810.3
11、064.08522.3829.0251.300.81样品提取之前先进行皂化处理，以去除不需要的成分（脂质、叶绿素等）和水解类胡萝卜素酯。如表2所示，随着碱浓度从20%增加到30%，叶黄素、玉米黄质和-隐黄质的含量呈现递增趋势，说明当碱液浓度较低时，叶黄素酯分散性不好，影响皂化反应进行，提取到的叶黄素含量低，随着碱液浓度的增加，皂化反应趋于完全，叶黄素提取率上升，当碱溶液浓度为30%时，叶黄素可以提取完全，继续增加碱液浓度，提取效果没有显著性差异（p0.05），故选择30%氢氧化钾水溶液作为实验皂化溶液浓度。表3 不同温度皂化测定结果（n=3）皂化温度（C）叶黄素含量(g/100g)玉米黄质含量
12、 (g/100g)-隐黄质含量（g/100g）25757.5520.31465.448.2042.792.3850795.5315.88501.2912.8648.363.1280656.8027.53383.5813.6834.471.76由表3可知，25 皂化后叶黄素、玉米黄质和-隐黄质的含量小于50（P0.05），说明，皂化10 min即可以皂化完全，皂化60 min时叶黄素、玉米黄质和-隐黄质的含量明显降低（P0.01），说明，皂化时间太长，会导致叶黄素、玉米黄质和-隐黄质的分解。因此，皂化时间选择10 min。综上所述，试样前处理最佳条件为：称取适量样品于250 mL三角瓶中，加入3
13、0 mL 含0.1% BHT的乙醇溶液和10 mL 30%氢氧化钾水溶液，于50恒温水浴摇床150 r/min避光皂化10 min，正己烷：乙醚：环己烷(2:2:1)混合液萃取，过膜后上机测定。3 色谱条件的选择和优化筛选参数：色谱柱、流速、流动相及洗脱程序。（1）选取以下4种色谱柱：A:YMCTM C30，5 m，4.6250 mm；B:Waters SunFire-C18-5m，4.6250 mm；C:Develosil C30-UG-5，4.6250 mmD:Phenomenex Synergi Hydro-RP 80R 4m，4.6250 mm。（2）2种流速：1.0 mL/min和0.8 mL/min。（3）2种柱温：30 C和40 C。（4）3种流动相及洗脱程序：A:流动相A-88%甲醇水溶液；流动相B-甲基叔丁基醚梯度洗脱；B:流动相是二氯甲烷：乙腈：甲醇(V:V:V=2:3:5)等度洗脱；C:流动相A-乙腈：甲醇(V:V=7:3)；流动相B-甲基叔丁基醚梯度洗脱。表5 色谱条件的优化色谱柱流动相流速柱温.分离度A1aYMCTM C30，5 m，4.6250 mm0-18.0 min,A相 0%-90%; 18.1-28 min, A相 90%-0%; 1.0 mL/min30 C1
