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1、新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定11 21 1 培养器皿的预处理: 包被 D -多聚赖氨酸: 将无菌处理的血盖片放入24孔聚乙烯培养板 ( Falcon) 或直径为35mm 的塑料培养皿 ( Falcon) 内, 在培养前24 小时用终浓度为50Lg/ ml 的多聚赖氨酸 50Ll/ cm2 包被血盖片及培养皿各孔, 37e 5% CO2 孵箱孵育过夜。临用前吸弃 D- 多聚赖氨酸液, HBSS液清洗2 次即可使用。1. 大鼠大脑皮质神经元的分离及培养2大鼠大脑皮质神经元的形态学观察光学显微镜: 细胞接种后, 每天在倒置相
2、差显微镜下观察神经细胞的生长情况, 拍照记录。台盼蓝染色计数活细胞 取 0.1 mL 的体积分数为 0.4% 台盼蓝加到 0.9mL 细胞悬液中, 充分混匀后立即滴加到血球计数板上并分别计数未染色的细胞数 (活细胞) 及染色的细胞数 (死细胞 )。用台盼蓝染细胞时, 活细胞拒染, 死细胞可摄取染料。计算公式: 每 mL原液的细胞数= 4个大方格的细胞总数 /4 X 104X稀释倍数。3-1神经元的免疫细胞化学鉴定Dapi + NF 3-2大脑皮质神经元纯度的鉴定( Nissl. s 染色)将细胞爬片的小玻片用 0. 01 mo l/ L 的PBS 漂洗, 40 g/ L 多聚甲醛固定, 再用
3、10 g/ L 甲苯胺蓝染色, 梯度酒精( 70%、80% 、95% 、100%) 分色, 置倒置相差显微镜下, 随机观察并计数 30 个视野( 目镜10 , 物镜 20 , 框面积 0. 3 mm2) 内的神经细胞数。连续观察10 d, 并拍照记录。神经元比例 ( % ) = NF阳性细胞数 /DAPI(+) 星形胶质细胞比例 ( % ) = GFAP阳性细胞数 /DAPI(+)鉴定NF 荧 光 免 疫 细 胞 化 学 染 色 : 神 经 丝( neurofilaments, NF) 蛋 白 是 构 成 神 经 轴 突 和 树 突 的 主 要 结 构成 分 , 在 中 枢 和 外 周 神 经
4、 系 统 的 神 经 元 细 胞 核 周 、特 别 是 轴突有表达, 也 是 神 经 元 特 异 性 标 志 物 之 一 。 固 定 后 的 细 胞 用PBS 洗 2 遍 , 每 次 5min, 0.4%triton X- 100 作 用 20min, PBS洗 3 遍, 山 羊 封 闭 血 清 封 闭 30min, 加 NF 单 抗( 1:50) 4孵 育过 夜 , PBS 洗 3 遍 , 加 FITC 标 记 的 羊 抗 鼠 二 抗 室 温 孵 育 3h( 避 光) , PBS 洗 3 遍 , 加 PI 作 用 10min, PBS 洗 后 加 50%的 甘油 PBS 封 片 , 激 光
5、共 聚 焦 显 微 镜 下 观 察 并 照 相 , 其 中 胞 浆 和核均着色者为阳性神经元 , 仅胞核着色者为阴性 细胞。4皮质神经元活性的测定( MTT 法) 1. 3. 3 海马神经元细胞活力 测定 3种培养液不同时间段(1、3、7和 10 d)海马神经元活力状况:1. 3. 3. 1 台盼蓝排斥实验5 取出 3组培养液培养不同时间段的神经元各 10孔,用等量的 0.15%台盼蓝浸染 5m in,分别在倒置相差显微镜 ( X400)下随机观察并计数 10个视野中神经细胞数 (细胞总数不少于 500个),根据不排斥染料的细胞数, 计算细胞的活力百分数。细胞的活力 (% ) =细胞总数-蓝染
6、细胞(死细胞) /细胞总数。 1. 3. 3. 2 MTT测定6 分别取 3组培养液培养不同时间段的神经元进行 MTT检测, 加入终浓度为0.1 5 g/L的 MTT, 4 h后弃去培养液, 再加入细胞溶解液 (含 40% N, N-二甲基甲酰胺, 10% SDS, pH41 0)溶解,用酶标仪测定各孔吸光度( K= 550 nm,OD值), OD值与细胞活性成正相关。 分别以1 X106 、1 x 105 / m L 细胞悬液接种于96孔细胞培养板中, 每个接种密度设 20 个重复孔, 同时设不加细胞的空白对照孔。每2 3 d 半量换液1 次。 从培养第1 d 起, 加M T T( 5 m
7、g/ m L) 到试验孔和空白孔中; 然后用铝箔纸包起培养板, 在 37 e 50m L/ L CO2 温箱中孵育4 h, 加DM SO 溶解M TT-甲结晶。读取D570 nm 值, 以空白孔读取空白对照值;连续测定10 d, 绘制出吸光度和培养天数关系折线图, 确定神经元活性最强的时间。将密度为 2 x 105/ cm2的单细胞悬液种植于铺过多聚-L-赖氨酸的 96孔培养板, 每孔 200 LL, 设 5个复孔。每天取 6孔, 每孔加入 5 m g /mL 的MTT 液20 LL, 37 e 、体积分数为 5% CO2 的饱和湿度下培养 4 h后取出, 去除上清, 每孔加 150 LL D
8、MSO , 振荡至蓝色颗粒全部溶解, 用酶标仪在 490 nm 处、干涉波长 655 nm 测出 A 值。根据A 值以各时间点吸光度的平均值为纵坐标, 时间 (天数) 为横坐标, 绘制生长曲线。摘要: 目的 研究体外原代培养新生大鼠海马神经元的方法, 并观察其发育分化过程中形态学的变化。方法生24 h内的W istar大鼠分离海马, 消化后差速贴壁, 种植在涂有多聚-L-赖氨酸的盖玻片上, 于不同时间在倒置显微镜下观察形态变化; 采用 NSE免疫细胞化学技术鉴定神经元。结果 神经元 12 24 h后大部分贴壁, 随时制成细悬液。转至塑料培养瓶中, 加入 10% FBS 置 CO2 培养箱 (
9、37 e 、5%CO2、95% 湿度 ) 内。差速贴壁 1h后, 收获贴壁速度慢的神经元, 用台盼蓝染色法进行活细胞计数, 以1 105的密度将细胞种植于 6孔培养板中, CO2 培养箱中培养24 h后全量换液, 以后每周 2 3次半量换液。每天在倒置相差显微镜下观察神经元的生长情况。关键 失败在细胞的分离过程中, 严格掌 握 脑 组 织 消 化 分离时间、细胞接种数量是较重要的。我们采 用 低 浓度 胰 蛋 白 酶 , 短 时 间( 0.125% , 15min) 消 化 的 方 法 ,尽可能减少分离过程中的化学损伤 , 这样更 好 保 持了细胞的活力。细胞接种密度亦是影响培养效果的。细胞接
10、种密度也是影响培养效果的重要因素,一般接种密度应维持在 1 105 1 106, 否则会因为密度太低使神经元缺乏相互间的支持和营养作用而死亡, 而密度过高神经元之间突起互相交错不便于观察单个神经元体外发育过程中的变化。差速贴壁是一种损伤小的纯化方法, 成纤维细胞、胶质细胞与神经元相比贴壁过程快; 而神经元在短时间内不附着或附着不稳定, 轻微震荡就可以浮起。本结果表明差速贴壁法可以达到较高的纯度, 同时又避免了对神经元的人为损伤。无菌环境 3曾用无血清的 DMEM /F12作为海马神经元体外培养的培养液, 本研究发现培养 24 h后,神经元几乎没有突起生成, 48 h后细胞全部死亡,加入一定量的胎牛血清后神经元生长良好,但胎牛血清具有不稳定性, 且实验过程中需要添加阿糖胞苷抑制神经胶质细胞的生长,阿糖胞苷的加入和去除, 反复更换培养液,变更细胞的生长环境会对神经元的生长造成不良影响。此外, 阿糖胞苷对神经元的生长也有一定的毒副作用。
