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1、农杆菌菌株的培养及感受态细胞的制备挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（链霉素100mg/ml），28振荡培养过夜取过夜培养菌液500l接种于50mlYEB（链霉素100mg/ml）液体培养基中，28振荡培养至OD600为0.5 左右。5000rpm离心5min，集菌。加10ml0.15MNaCl悬浮细胞，5000rpm离心5min，加10ml预冷的20mMCaCl2悬浮细胞，冰浴，24小时内使用，或分装成每管200l，液氮中速冻1min，置于-70保存备用。植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化取200ml 感受态细胞，加入1g构建好的质粒DNA加入到，混匀后，冰浴30
2、min。液氮中速冻2-3min，37水浴5min，接着冰浴3min。加入1mlYEB培养基，28摄氏度慢速震荡培养4h。5000rpm离心5min，弃上清，集菌。加入0.1mlYEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100mg/ml Kan和125mg/ml Sm的YEB平板上，28培养阳性克隆的鉴定挑取平板上长出的单菌落，接种于含有100mg/ml Kan和125mg/ml Sm的YEB液体培养基中，28振荡培养过夜，小量提取质粒DNA，以质粒DNA为模板进行PCR扩增鉴定。农杆菌菌液的制备挑取继代2d后的农杆菌单菌落，在加有相应抗生素的液体YEB培养基中，在28黑暗条件下震荡培养16-20h（
3、OD600为0.6-0.8）将菌液置于离心管中，18-20，5000rpm离心5min收集菌体。将收集到的菌体用2mlD-inf液体培养基悬浮进行洗涤，以去除残余的YEB培养基18-20，5000rpm离心10min收集菌体，将菌体用2mlD-inf液体培养基，加入1AS，备用（放1h）农杆菌感染玉米幼胚初生愈伤及共培养将加入到D-inf（含AS）的菌液稀释到OD600为0.3-0.5放置1h以上，将幼胚或愈伤用D-inf（不含AS）洗一次，再浸入菌液中，用手 上下颠倒30s，并放置5min，观察幼胚无明显伤口时，取出，用无菌滤纸吸干，放到D-AS固体培养基上，25黑暗条件下共培养3d，同时设
4、对照。植物受体材料幼胚、愈伤组织的制备愈伤组织的准备：玉米授粉后10-13d，取玉米幼穗在超净台上剥去苞叶，取出幼胚，将幼胚盾片朝上，接种于D培养基上，每培养皿接20-40个幼胚，28培养2-3d后，即可诱导出愈伤组织。幼胚的准备：剥去苞叶、丝及一些多余部分，用刀插入上部，放入70%的乙醇，进入超净台，30s，拿出，超净台上吹干约15-20min，剥去玉米粒的2/3的表面部分，剥幼胚。玉米转化体的筛选、继代和植株再生恢复培养的阶段：将共培养3d后的幼胚在灭菌水（加1的cef）中洗3次，每次20min，然后用滤纸吸干，转入D-cef固体培养基上，25，暗处，恢复培养7d。选择加压筛选阶段：分4次
5、第一轮 D培养基+cef（1）+PPT（5mg/ml）第二轮 D培养基+cef（1）+PPT（10mg/ml）第三轮 D培养基+cef（1）+PPT（10mg/ml）第四轮 D培养基+cef（1）+PPT（10mg/ml）每轮间隔均为2周；其中AgNO3可加（1或0.5）可不加，或一次加而另一次不加；cef使用浓度250mg/L，存储液浓度为250mg/ml；PPT存储液浓度为10mg/ml。筛选后的恢复阶段：D培养基+6-BA（5mg/L），其中2,4-D或Dicamba浓度稀释5倍，蔗糖30g/L（或蔗糖20g/L，葡萄糖10g/L），时间为2周，暗培养。筛选后的诱导阶段：D培养基+6-B
6、A（5mg/L），其中2,4-D或Dicamba浓度稀释5倍，蔗糖50g/L，不加葡萄糖+cef1ml/L，暗培养。分化阶段：D培养基，但不加任何激素，蔗糖浓度30mg/L不加葡萄糖，+cef1ml/L，光照培养。生根阶段： 培养基及母液的配置D-培养基NaFeEDTA 10ml/LN6 macro 50ml/LB5 micro 10ml/LDi comba(2,4-D) 1ml/L(5ml/L)RTV 10ml/LCasamina acids(酪蛋白水解酶) 0.5g/LL-Prine 700mg/L肌醇 100mg/LSucrose 20g/LPH 5.8N6大量元素组成成分 终浓度(mg
7、/l） 20（g/L）硝酸钾 KN03 2830 56.6硫酸铵(NH4) 2SO4 463 9.26硫酸镁 MgSO47H20 185 3.7 磷酸二氢钾 KH2PO4 400 2.58氯化钙 CaCl22H2O 166 3.32(或无水氯化钙CaCl2 2.58 ) 配2L时，称取6.64gCaCl22H2O溶于600-700ml蒸馏水中，称取其他成分溶于600-700ml蒸馏水中，分别溶解后，再混合到一起，定容至2000mlB5微量元素 组成成分 终浓度(mg/l） 100（mg/500ml）MnSO4H2O 10 378.93MnSO44H2O 10 500ZnSO47H2O 2.0
8、100H3BO4 3.0 150KI 0.75 37.5Na2MoO42H2O 0.25 12.5CoCl26H2O 0.025 1.25CuSO45H2O 0.025 1.25Fe盐组成成分 终浓度(mg/l） 100（mg/500ml）Na2EDTA 37.3 1.865 FeSO47H2O 27.8 1.390Na2EDTA用温水溶解，放于50水浴，后将FeSO47H2O加入，定容至500ml。 Dicomba(MW:221.0) 335.1mg/100ml=3.315mg/ml (15m) 用2,4-D母液200 5ml/L（2g/L）RTV（100 ，500ml体系）组成成分 终浓度
9、(mg/l） 100（mg/500ml） mg/1000mlChloride Acid （139.63） 0.0977 4.885 9.770（氯化胆碱）Riboflavin(VB2，376.4) 0.0489 2.445 4.890（核黄素）D-Biotin （VH，244.3） 0.10016 5.008 10.016（生物素）Folic Acid 0.0485 2.425 4.890（叶酸）（用氨水单独溶解，再加蒸馏水定容）Nicotinic Acid （123.11） 0.1994 9.97 19.94 （烟酸）Thiamine HCl （VB1，337.3） 0.47222 23.6
10、11 47.222 Ca-pantothenate （476.53） 0.1000 5.0 10.0（D-泛酸钙）Pyridoxine HCl （VB6，205.6） 0.1994 9.97 19.94（盐酸吡哆辛）C-fane cobalamin （VB12，1355.39） 0.000135 0.00675 0.0135P-Aminobenzoic acid (137.13) 0.0494 2.47 4.94（对氨基苯甲酸）以上各种维生素除叶酸外均溶于水，叶酸需先用氨水单独溶解，再加蒸馏水。YEB培养基酵母提取物 1g/L蛋白胨 10g/L蔗糖 5g/LMgSO47H2O 0.5g/LPH 7.5YEP培养基酵母提取物 10g /L 胰蛋白胨 10g/LNaCl 5g/PH 7.0LB培养基胰化蛋白胨 10g/L酵母提取物 5g/L NaCl 10g/L 琼脂粉 15g/LD-AS培养基NaFeEDTA 10ml/LN6 macro 50ml/LB5 micro 10ml/LDicomba(2,4-D) 1ml/LRTV 10ml/LCasamina acids(酪蛋白水解酶) 0.5g/LL-Prine 700mg/L肌醇 100mg/LSucrose 20g/L葡萄糖 10g/LPH 5.8琼脂粉 8g/LAS(0.5M) 200lAgNO3 1ml/LA
