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1、一、什么叫植物组织培养技术？它有哪些类型？其理论依据是什么？（1）广义的植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌和人工预知的控制条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织或细胞进行离体培养，使其再生细胞或生长、分化成完整植株的技术。狭义的植物组织培养仅指对植物的组织（如分生组织、表皮组织、薄壁组织等）及培养产生的愈伤组织（callus）进行离体培养的技术。（2）类型：植株的培养；胚胎培养；器官培养；组织培养；细胞培养；原生质体培养。（3）植物细胞全能性（totipotency）是植物组织培养的理论基础。它是指一个生活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会
2、有一整套发育成一个完整植株的全部遗传信息，在适当的条件下，这些信息可以表达，再生成一个完整植株。三、试述目前植物组织培养的应用。答：（1）植物离体快繁、（2）无病毒苗木培育、（3）培育新品种或创制新物种、（4）次生代谢物生产、（5）种质资源保存（6）人工种子。一、简述培养基和器具的灭菌方法和技术。培养基的灭菌方法：高压蒸汽灭茵法 ：培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围（1.15kgfcm-2或O.15MPa ，温度126 )；否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。 过滤除菌法：过滤灭菌的原理是溶液通过滤膜后，细菌的
3、细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。器具的灭菌方法：（1）干热灭菌法干热灭菌法是将器具长时间放在高温下消除杂菌的一种方法。其具体做法是将需要灭菌的器具(玻璃器皿或器械)先用铝箔包好，放入温度设定为150的恒温干燥箱内，保温2h，取出冷却后便可以使用。（2）高压蒸汽灭茵法高压蒸汽灭菌法是将需灭菌的玻璃器皿、器械或培养基等放在高压蒸汽灭菌锅内，通过高温高压进行灭菌的一种方法。一般在1.06 kgcm2的压力下(121 )下保持1520min，就可达到灭菌效果。对于无菌操作所用的各种器械，如镊子、解剖刀、解剖针等，可采用灼烧灭菌。一般的消毒办法是把它们先在95酒精中浸一下，然后再置火焰上灼烧，然后放在
4、灭过菌的支架上，待冷却后使用。二、简述植物材料消毒的一般过程。第一步：材料的修整、刷洗、冲洗。第二步：是用洗衣粉水或肥皂水浸洗并搅动。第三步：材料的表面灭菌。四、简述植物组织培养无菌操作技术的一般过程。目前多数实验室都使用各种类型的超净工作台进行无菌操作。具体的无菌操作步骤如下：在实验之前30min将超净工作台的紫外灯打开，进行灭菌。工作人员要避免紫外线照射。做实验时将紫外灯关闭。用酒精喷壶或酒精棉将超净工作台消毒（酒精浓度为70）。实验操作前，工作人员的手和小臂用70酒精消毒。使用的镊子、解剖刀等用90酒精浸泡，之后放在酒精灯上火烧灭菌，再放在灭菌支架上冷却后使用。在植入或移植材料的前后，培
5、养瓶的瓶口须在酒精灯火焰上烧烤灭菌。第二章一、常用培养基分为哪几类？各类的主要特点是什么？MS培养基答：（1）MS培养基：特点是无机盐的浓度高，有加速愈伤组织生长的作用，能满足植物组织对矿质营养的要求。铵盐和硝酸盐含量高，比例也比较适合，也不需要添加更多的有机附加物，这是目前应用最广泛的一种培养基。但它不适合生长缓慢、对无机盐浓度要求较低的植物，尤其不适合过高易发生毒害的植物。White培养基：特点是一个无机盐浓度较低的培养基。它的使用也很广泛，同时它还非常适合于生根培养和胚胎培养。B5培养基：它的主要特点是含有较低的铵盐，该营养成分可能对不少培养物的生长有抑制作用，对有些植物如双子叶植物（如
6、豆科植物）特别是木本植物，却更适合生长。N6培养基：其KN03和(NH4)2S04含量高且不含钼，广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养。SH培养基：与B5相似，不用(NH4)2S04而改用NH4H2P04，在不少单子叶和双子叶植物上使用，效果很好。马铃薯简化培养基是为适应经济条件较差的农村农科站和中学而设计的，既经济又适用，容易取材，有利于组培技术推广和普及。二、培养基的成分有哪些？各有什么作用？答：目前，不论液体培养还是固体培养，大多数植物组织培养中所用的培养基都是由水、无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。（1).水分：生物的生命活动离不开
7、水分，构成培养基的绝大部分组分为水分。(2).无机营养物(无机盐)：提供植物所必需的16种营养元素(3).碳源和能源：作为生长发育的能源；具有维持培养基一定渗透压的作用( 4).维生素类：与植物体内各种酶的形成有关，在植物组织培养中通常以B族维生素为主)(5).氨基酸及有机附加物：是培养基中重要的有机氮源，最常用的是甘氨酸，它能促进离体根的生长，对植物组织培养物的生长也有良好的促进效果(6) 植物生长调节物质：生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质，其用量虽极少，但它们对外植体愈伤组织的诱导和器官分化起着重要和明显的调节作用，其中以生长素类和细胞分裂素类最为常用。生长素类常用的是2,4D(2
8、，4二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)，它们作用的强弱顺序为：2,4D NAA IBA IAA。在培养基中加入细胞分裂素的目的，主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽。作用的强弱顺序为：TDZ，4PU ZT 2iP 6BA KT(7)琼脂：它的主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢(8)其他成分： 活性炭减少一些有害物质的影响，性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根，对形态发生和器官形成有良好的效应。硝酸银起到促进愈伤组织器官发生或体细胞胚胎发生的作用，并能使某些原来再生困难的物种分化出再生植株。抗生素防止由外植体内生菌造成的污染，减少培
9、养物中材料的损失。防止酚类物质污染的添加剂洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌后加入固体培养基的表层.一、简述植物细胞全能性、细胞分化、脱分化与再分化的概念。（1）植物细胞全能性（totipotency）是指一个生活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的全部遗传信息，在适当的条件下，这些信息可以表达，再生成一个完整植株。（2）细胞分化(differentiation)是指生物在个体发育过程中细胞由一般变为特殊的现象，即普通形态结构的细胞，向着不同形态结构的方向发展，从而在机能上也各不相同。（3）脱分化(dedifferentiation)由失去分裂能力的细
10、胞回复到分生性状态并进行分裂， 形成一种高度液泡化的呈无定形态的薄壁细胞即愈伤组织的现象（4）再分化（redifferentiation）由无分化的愈伤组织的细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功能的细胞团和组织，进而构成一个完整的植物体或植物器官的现象（或过程），二、再分化有哪几种方式？它们的特点是什么？再分化有两种途径，一种是器官发生 (organogenesis)途径，一种是胚胎发生(embryogenesis) 途径。前者具体包括：先形成芽，后在芽基部长根；先形成根，再从根基部形成芽；在愈伤组织不同部位分别形成芽和根，然后根、芽的维管束接通形成完整植株；仅形成芽或根（如茶树的花粉愈
11、伤组织诱导器官分化时，往往只形成根，而芽的发生则十分困难）。在大多数情况下，再分化过程是在愈伤组织细胞中发生的，但在有些情况下，再分化可以直接发生于脱分化的细胞中，无须经历愈伤组织阶段。 四、试述优良愈伤组织应用具备的特点及获得优良愈伤组织的方法。 特点（1）高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植株。 （2）容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性原生质体。 （3）旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。 （4）经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操作。方法（1）选择适当的基因型和适当的外植体。（
12、2） 选择正确的培养基，（3） 采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱导培养基和培养条件。其中最主要的是植物激素和氮源形态。影响茎芽分化的因素有哪些？(1)化学因素大量的实验证明，影响茎芽分化的化学因素主要是培养基中生长素和细胞分裂素的浓度和比例，当生长素的相对浓度较高时，有利于细胞的增殖和根的分化，若细胞分裂素的相对浓度较高，则促进芽的分化，当这两种激素之间的比例适中时，则仍产生无结构的愈伤组织。(2)物理因素包括培养基的状态、光照、温度等。 光照因素包括光照强度、光照时间和光的质量。第四章 体细胞胚胎发生一、植物体细胞胚胎发生的概念是什么？有哪些途径？（1）由单细胞或一群细胞被诱导不断再生非
13、合子胚，并萌发形成完整植株的发育过程称为体细胞胚胎发生。（2）直接途径是指从培养中的器官、组织、细胞或原生质体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎，中间不经过愈伤组织阶段 间接途径是指外植体先脱分化形成愈伤组织，再从愈伤组织的某些细胞，即重新“决定”为胚性细胞的细胞分化出体细胞胚胎这种方式的胚状体形成通常分两个阶段完成：胚胎发生丛（embryogenic clump，EC）的形成。胚状体的发育三、长期培养物形态发生潜力丧失的可能原因有哪些？（1） 遗传假说，培养细胞中细胞核物质变化，如多倍性、非整倍性和染色体结构突变，可能与长期培养物器官发生或胚胎发生潜能丧失有关。这种由遗传原因造成的形
14、态发生潜力的丧失是不可逆的。（2） 生理假说在某些情况下，形态发生潜力的下降可能是由于细胞或组织内激素平衡关系的改变造成的，或是由于细胞对外源生长物质敏感性的改变造成的。（3）竞争假说 在复合多细胞外植体中，只有少数细胞能产生胚性细胞团，其余细胞没有细胞全能性。四愈伤组织培养中存在哪两种类型的细胞？它们的特点是什么？ （1）紧密型（compact）：愈伤组织内无大的细胞间隙，细胞间被果胶质紧密结合，不易形成良好的悬浮系统。（2）松脆型（friable）：愈伤组织内有大量大的细胞间隙，细胞排列无次序，容易分散成单细胞或少数几个细胞组成的小细胞团，是进行悬浮培养的最合适的材料。两类愈伤组织通过激素
15、调节可互相转变。五简述制造单胚人工种子的方法和工业化生产人工种子的步骤。植物人工种子是指将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育为完整植株的分生组织（芽，愈伤组织，胚状体）包埋在含有营养物质和具有保护功能的外壳内形成的在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体1方法：（1）人工种子由包裹在防护层中的体细胞组成，在制造单胚人工种子的时候，主要采用诸如藻酸钠一类的水凝胶作为体细胞胚的包被物质。（2） 当体细胞胚与藻酸钠混合以后，再滴人到硝酸钙或氯化钙溶液中，30 min内表面即可完全络合，形成一层持久的种皮（3） 在种皮基质中还可加入一些对体细胞胚有益的物质，如能促进生长的微生物、营养物质、生长调节物质、杀虫剂以及用于旱地播种的亲水性化合物等作为人工胚乳。2步骤，首先，必须建立起适当的组织培养技术，从中能产生高质量的大小一致和发育期同步的、功能像合子胚一样的体细胞胚。为了促成体细胞胚的同步发育，现在常常采用的方法有以下3种： （1）在细胞培养初期，于培养基中加入DNA合成抑制剂如5氨基尿嘧啶等，使细胞分裂暂停，或将培养物置于低温之下，以抑制细胞分裂。一定时间之后，除掉抑制剂或转入正常温度下培养，以促使细胞同步分裂。 （2）将培养细胞用不同直径的玻璃珠或不同孔径的尼龙网过滤，以收集不同发育时期的胚状体。 （3）利用渗透压控制胚胎发育
