红树林内生真菌抗细菌和抗真菌活性的初步研究 【摘要】 目的 分离和筛选具有抗细菌和抗真菌活性的红树林内生真菌方法 从红树林植物桐花树、海漆、秋茄、木榄、白骨壤、银叶树中分离到60株内生真菌，对其代谢产物进行抗菌检测，通过滤纸片法来检测内生真菌代谢产物抗细菌和抗真菌活性结果 共有35株内生真菌具有抗细菌活性，占待侧菌株总数的％，其中以不产孢类、青霉属、曲霉属、镰孢属为主，分别占活性菌株总数的％、％、％、％；共有49株内生真菌具有抗真菌活性，占待侧菌株总数的％，其中以不产孢类和盘长孢属为主，分别占活性菌株总数的％、％ 结论 红树林内生真菌是抗菌活性物质的一个潜在的、丰富的资源库，值得进一步研究和开发 【关键词】 红树林；内生真菌；代谢产物；生物活性 Abstract:Objective To isolate and screen fungal endophytes with antibacterial and antifungal activities from mangrove The antibacterial and antifungal activities test of fungal endophytes from mangrove plants were used by paper disc Sixty strains of endophytic fungi were isolated from Aegiceras corniculatum, Excoecaria agallocha, Kandelia candel, Bruguiera gymnorrhiza, Avicennia mariana, Heritiera result of the antibacterial and antifungal assay shows that thirty five strains of the endofungi (% of total tested strains ) have antibacterial activities, the active strains mostly belong to sterile groups ( % of active strains), Penicillium(%), Aspergillus(%), Fusarium(%); forty nine strains (% of total tested strains) have antifungal activites, most of them belong to sterile groups ( % of active strains), and Gloeosporium (%).Conclusion Mangrove fungal endophytes were potential and rich resources of antimicrobial compounds, which need to explore further. Keywords: mangrove plants, fungal endophytes, metabolites，bioactivity 内生真菌(endophyte)指生活于健康植物组织内部、不引发植物产生明显病症的一类真菌。
但在植物衰老或外界刺激条件下，植物自身免疫力下降，也可能出现某些病症它们全部或部分生活周期生活在植物组织内这类真菌生活在植物体这一特殊生境中，不但能促进植物的生长发育［1］，提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力［2］，还能产生多种具有生物活性的次生代谢产物，在医药业、农业的生物防治方面都显示出重要的应用价值［3］ 1993 年, Strobel 等［4］等从短叶红豆杉(Taxus brevifolia) 的韧皮部中分离到一株能产紫杉醇（Taxol) 的内生真菌（Taxomyces andreanae)，受此启发,国内外学者也相继在其他陆生植物开展此方面的研究，并从中分离具有多种具有抗肿瘤活性、抗真菌活性、免疫抑制活性的内生真菌［5,6］红树林作为生长在热带和亚热带海湾河口潮间带的一种特殊的生态系统，一直处于高盐、频繁的潮汐、强风、高温、强紫外辐射和缺氧污泥的海陆潮间带环境［7］，其生境非常特殊，研究发现它们自身许多成分也具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等药用价值［8］它们的内生真菌同时又具有海洋微生物的特点，这也使得红树林内生真菌具有独特的代谢途径和遗传背景，其种类和产物化学类型多样性也比较丰富，因此有可能从中发现一些新的真菌种类和新的代谢产物。
本研究对深圳福田红树林自然保护区的6种红树林的内生真菌进行了较为系统的分离，并从中筛选具有抗菌活性的菌株，为开发新的抗菌药物提供基础 1 材料与方法 植物样品来源 在深圳福田红树林保护区采集桐花树（Aegiceras corniculatum）、 海漆（Excoecaria agallocha）、秋茄（Kandelia candel）、木榄（Bruguiera gymnorrhiza）、白骨壤（Avicennia mariana）、银叶树（Heritiera littoralis）的叶、茎、根、树皮、气生根等样品，采集后放于冰盒中保存, 4 h内处理样品，进行内生真菌的分离 培养基 PDA培养基 马铃薯200 g ,葡萄糖20 g ,琼脂15 g ,50％人工海水1 000 mL 真菌发酵培养基 2％葡萄糖， 1％蛋白胨，％酵母膏，50％的人工海水，pH LB培养基 称取10 g 蛋白胨 、5 g 酵母膏、10 g NaCl，加蒸馏水溶解后，调pH至，定容至1 000 mL。
促孢培养基 KH2PO4 1 g , KNO3 1 g ,MgSO4·7H2O g ,KCl g ,淀粉 g ,葡萄糖 g ,蔗糖 g ,琼脂 15 g ,水1 000 mL 拮抗试验菌株 试验细菌 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus NICPBP 26112)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus )、大肠杆菌 (Escherichia coli ATCC 8739)、青枯菌（Ralstonia dolaanacearum）分离于番茄植株 试验真菌 假丝酵母菌(Candida albicans ATCC 10231)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )均购自广东省微生物研究所新月弯孢霉(Curvularia lunata) 由本实验室保存；茄丝核菌（Rhizoctonia solani K）分离于患病番茄植株；叶枝霉 (Cladosporium herbarum)分离于患病番茄植株；尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) 分离于香蕉植株。
植物内生真菌的分离 叶、叶脉、茎、树皮（韧皮部）等样品用自来水冲洗掉泥土，然后进行严格的表面消毒程序：依次浸泡在75％酒精1min，3%～5%有效氯的次氯酸钠溶液3 min，75%的酒精 min， 然后再用无菌水冲洗3遍晾干后，在超静台将其剪成约 cm× cm 左右小片将处理好后剪成的小片铺于PDA平板上，加入氯霉素与链霉素各50 μg/mL抑制细菌的生长，在26 ℃培养培养2～3 周分离内生真菌这些平板在第1周要每天检查1次，然后可以3、4 d检查1次一旦发现有菌丝从组织小块长出，应马上将其转接到另一新的平板上，经几次纯化保存于PDA斜面 表面消毒效果检查 参考文献［9］ 方法观察表面消毒效果 内生真菌的鉴定 使用PDA 培养基, 采用载玻片法培养内生真菌, 根据《真菌鉴定手册》［10］中描述的真菌形态特征进行鉴定不产孢子的菌株，需使用催孢培养基或紫外线照射来诱导孢子的产生仍不产孢者归不产孢类 内生真菌发酵及代谢物提取 分离到的红树林内生真菌斜面培养物经活化后分别接种至20 mL真菌发酵培养基，26 ℃摇床上以190 r/min的转速培养7～10 d，发酵结束后将发酵物冷冻干燥，再用10 mL甲醇浸泡抽提1 d。
取甲醇提取液清液，挥发干后，用2 mL甲醇溶解配成10倍浓缩液 内生真菌代谢物抗细菌、抗真菌活性检测 采用滤纸片法进行抗菌活性检测: 活化后的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌与青枯菌培养液用无菌水稀释至10-4，取 mL菌悬液（约105 cfu/mL）涂布于LB平板上用滤纸片（直径5 mm）吸取内生真菌代谢产物粗提物溶液，放置于平板上，37 ℃培养1～2 d，观察抑菌圈的大小及有无白色念球菌除取10-3稀释液200 μL涂布PDA平板外，其余均与细菌相同，并用空白滤纸片吸取甲醇溶液作为空白对照；将丝状病原真菌接种于PDA培养基平板中央，在病原菌周围放置用粗提物浸过的滤纸片，培养3～5 d后观察病原菌菌落生长情况，并用空白滤纸片吸取甲醇溶液作为空白对照 2 结果 红树林内生真菌的分离 本研究从深圳福田红树林保护区的6种红树林多个部位共分离到60株内生真菌作为抗细菌活性和抗真菌活性的待筛菌株，并对它们进行了分类鉴定，结果见表1从表1可以看出，分离到60株红树林内生真菌包括11个属和不产孢类，其中以不产孢类、盘长孢属、镰孢属、曲霉属为主要类群，分别占％、％、％、％。
表1 60株待筛菌株种类及来源（略） The taxa and origin of 60 endophytic fungi which are screened 红树林内生真菌的抗细菌活性 从表2可以看出，在60株待筛红树林内生真菌中，有35株内生真菌的代谢产物对一种或多种指示细菌有抑制活性，占待筛菌株的％，这说明红树林内生真菌存在着丰富的抗细菌资源 红树林内生真菌的抗真菌活性 红树林内生真菌对细菌的拮抗实验结果见表2从表2可以发现，60株待筛红树林内生真菌甲醇代谢产物有49株（占%）的代谢产物具有抗真菌活性；其中有42株内生真菌的代谢产物对丝状真菌具有抗性，占待侧菌总数的％；有22株红树林内生真菌的代谢产物对人类皮肤深部感染病菌－假丝酵母菌有抗性，占待侧菌总数的％实验结果表明，红树林内生真菌蕴藏着丰富的抗真菌活性物质产生菌，是开发抗真菌药物的潜在资源 &nb1 / 1。