第一部分 组织和细胞蛋白样品的制备1 材料和方法1.1 材料组织和细胞的来源：仪器设备机械组织匀浆器低温高速离心机 (>40,000 g)超速离心机超生细胞破碎仪超纯水装置1.1. 3 试剂三氯醋酸 (TCA)丙酮二硫苏糖醇 (DTT)尿素CHAPSPMSFEDTA乙醇磷酸考马斯亮蓝 R350抑肽素 A亮肽素●试剂纯度均应是分析纯或以上溶液配制(1) PBS：NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na 2 HPO4 1.44 g, KH 2PO4，溶于 800 ml 水中，用 HCl 调 pH 至 7.4，用纯水定容至 1 L ；(2) EDTA 储存液：18.61 g Na2EDTA ·2H 2O，溶于 70 ml 纯水中，用 10 mol/L NaOH 调节 pH 值至 8.0 ( 约需 2 g NaOH 颗粒 )，定容为 100 ml 可高压灭菌后分装备用；(3) 亮肽素储存液 (50 μg/ml ， 100 ×)10 mg/ml溶于水，-75℃保存；使用时配成50 μg/ml储液，-20℃保存；(4) 抑肽素储存液(70μg/ml ， 100 ×)1 mg/ml 溶于甲醇， -75℃保存；使用时配成70 μg/ml储液， -20℃保存；(5) PMSF 储存液 (10 mM, 100 ):×17.4 mg PMSF ，溶于 1ml 异丙醇中， -20℃ 保存。
6) DTT 储存液 (1 M):0.31 g DTT 溶于 2 ml H 2O 中，-20℃ 保存 (DTT 或含有 DTT 的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌 )7) 裂解液 :Lysis buffer A(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Final concentrationAmountUrea(FW60.06,9 M10.8 gSigma, >99.5%)CHAPS(FW614.89,4% (w/v)0.8 gSigma, >98%Ultrapure H2Oto 20 mlprepare fresh or store in aliquots at–20℃A cocktail ofproteaseinhibitorsDTT(FW 154.25, Promega)1%13 μ L/200 μ L Lysisbuffer(15.5 ×stock),-20℃Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer C40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H 2OLysis buffer D(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)Final concentrationAmountUrea (FW 60.06)8 M9.6 gCHAPS4% (w/v)0.8 gTris base (FW 121.1)Ultrapure H2Oto 20 mlprepare fresh or store in aliquots at–20℃A cocktail ofproteaseinhibitorsDTT(FW154.25, 1%13 μ L/200 μ L LysisPromega)buffer(15.5 ×stock),-20℃Lysis buffer E(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktailof protease inhibitors )Final conc.AmountUrea5 M3.0 gThiourea(FW2 M1.52 g76.12)SB 3-10 (FW 307.5)2%0.2 gCHAPS2%0.2 gUltrapure H 2Oto 10 mlAcocktailofprotease inhibitorsDTT(FW 154.25,1%13 μ L/200μ LLysis bufferPromega)(15.5 stock),×-20℃Lysis buffer F100 μLSDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/vglycerol)●CA 、蛋白酶抑制剂混合物和 DTT 在临用前加入。
8) 蛋白酶抑制剂混合物 [3]成分终浓度蛋白酶抑制剂混合物 PMSF35 μg/ml or 1 mMEDTA0.3 mg/ml (1 mM)抑肽素0.7μg/ml亮肽素0.5μg/ml1.2 方法组织蛋白提取方法1.3.三氯醋酸 /丙酮沉淀法 [1](1) 冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步；(2) 在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织；(3) 将粉末悬浮于含 DTT (0.2% w/v) 的 10%三氯醋酸（ w/v）的丙酮溶液中；(4) 蛋白 –20℃沉淀过夜；(5) 35 000 ×g (6℃ ) 离心 30 min ；(6) 将沉淀重悬于含 0.2% DTT 的预冷丙酮中；(7) -20℃放置 1 h；(8) 35 000 ×g (6℃ ) 离心 30 min ；(9) 在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀；(10) 在裂解液中重新溶解沉淀（ 50-100 mg 组织需要 1 ml 裂解液）；(11) 15℃ , 40 000 g×，离心 1hr；(12) 用 Bradford 法 [2] 测定上清的蛋白浓度，分装后置 –75℃保存。
超速离心法(1) 取材；(2) 用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每 1 g 样品加入 0.5 ml 裂解液，使用组织匀浆器匀浆 30 s；(3) 组织悬液 15℃， 10 000 ×g离心 10 min；(4) 上清液 4℃， 150 000 ×g超速离心 45 min；(5) 小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清 6℃ 40,000g 再次离心 50min；(6) 取离心上清 Bradford 法定量，分装后置 –75℃保存培养细胞蛋白提取循环冻融法(1) 吸出培养液弃去， 0.01 mol/L PBS 洗一次；(2) 加入 PBS，用橡胶刮收集细胞于 10 ml 离心管中；(3) 500×g，离心 5 min；(4) 弃上清， PBS 洗三次（室温 ,500 ×g，5 min），(5) 在离心管中加入 1ml PBS，重悬细胞，用 1 ml 微量加液器移入 Eppendorf 管中；(6) 执行 Biofuge 存储程序 8，500×g 5 min 离心；(7) 用 200 μl微量加液器吸出 PBS，弃去；(8) 吸干残留的 PBS，估计样品体积，加入 5 倍体积裂解液，巴氏滴管混匀，液氮中反复冻融三次 (每次置液氮中 3 s， 室温融化 )，DTT 在第一次冻融后加入；(9) 执行 Biofuge 存储程序 6，15℃， 40 000 ×g，离心 1hr (Biofuge) ；(10) 上清 Bradford 法定量，沉淀 -75℃保存备用。
超声破碎法(1) 取对数生长期的细胞，吸出培养液弃去， 0.01 mol/L PBS 洗一次；(2) 加入 PBS，用橡胶刮收集细胞于 10 ml 离心管中；(3) 室温， 500×g，离心 5 min；(4) 弃上清， PBS 洗 3 次（室温 ,500 ×g， 5 min）；(5) 在离心管中加入 1ml PBS，重悬细胞，用 1 ml 微量加液器移入 Eppendorf管中， 500×g 离心 5 min；(6) 吸干残留的 PBS，估计样品体积，加入 5 倍体积裂解液，混匀，移入 1.5ml Eppendorf 管中，冰浴中以最大功率超声破碎细胞（3×10 s）；(7) 15℃, 40 000 g×，离心 1hr (Biofuge)；(8) 上清 Bradford 法定量，沉淀 -75℃保存备用2 结果和讨论蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、 裂解细胞、 离心除去膜组分等获得溶解的蛋白质上清我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法； 破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法 循环冻融法操作简便， 比较适合提取培养细胞的稳定蛋白， 我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。
使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度， 即刚好低于溶液产生泡沫的水平 因为产生泡沫会导致蛋白质变性， 同时要注意散热 匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一 由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小， 所以匀浆是简便、 迅速和风险小的组织破碎方法， 我们实验室在破碎脑和脊髓组织时常用此法； 由于神经组织比较柔软，液氮研磨法也很适合， 本实验中我们使用了这一。