实验五、营养缺陷型菌株筛选及鉴定1、 实验名称营养缺陷型菌株筛选及鉴定2、 实验操作人3、 实验过程简述3.1营养缺陷型菌株诱变3.1.1培养基的配制配置两种类型的培养基，营养丰富培养基（YPD）和基本培养基（SC），其中 营养丰富的培养基在诱变的过程中用来培养菌株，在基本培养基中选择性的加入 氨基酸来进行筛选，分别标记为：SC5 （SC+His+Trp+Leu+Lys+Ura） ； SC5-Lys （SC+His+Trp+Leu+Ura） SC5-Leu （SC+His+Trp+Lys+Ura） ； SC5-Trp （SC+His+Leu+Lys+Ura） ； SC5-His （SC+Trp+Leu+Lys+Ura） ； SC5-Ura（SC+His+Trp+Leu+Lys）3.1.2稀释涂布在超净台，取0.1 ml菌悬液转接到0.9 ml无菌水中，混匀后，取0.1 ml 稀释液转接到0. 9 ml无菌水中，混匀后，继续进行10倍的梯度稀释，稀释到 10-6 ；取0.1 ml稀释度分别为10-4、10-5、10-6的菌悬液，加入到YPD固体平板 上，用涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂5块平板；3.1.3紫外诱变每个稀释度各取一块平板，培养皿底部标记好组号-稀释度-紫外处理时间， 将平板适当垫高，防止诱变不充分，用紫外照射分别诱变处理0、30、45、60、 120秒，黑布包好，置于30°C培养箱培养48h；记录各平板上的菌落数，计算不 同处理的细胞致死率。
致死率（%） =1-（特定时间点平板上菌落数X稀释倍数）/ （0时平板上菌落数X 稀释倍数）X100%3.2营养缺陷型菌株初筛3.2.1选取单菌落小组内部四人分别标号为A/B/C/D （本人标号为A）,本次实验选用了两种敏 感性不同的菌株，选取两种菌株内生长较好的平板，每个平板每人取3个单菌落 （每人2菌X3个单菌落），用记号笔圈出标记为A1/A2/-A6防止重复挑取；取 1.5ml离心管装入1ml无菌水，用接种环从YPD平板上挑取单菌落，转接到无菌 水中，摇匀，室温静置2h；3.2.2点板在准备好的YPD、SC培养基平板底部做标记（培养基名称-组号），将小组成 员点菌位置画好格子；分别取一接种环菌悬液对应点于SC和YPD培养基平板上 （每人1行，做好标记）；将培养皿倒置于30C培养箱中，培养48h，注意无论 涂板、还是点板，一定等菌液被培养基吸收后，再挪动或倒置；记录各单菌落在 不同培养基上生长情况（生长记“ + ”，不生长记“-”），并拍照；根据生长情况， 判断本实验各菌株是否为营养缺陷型菌株4、主要实验结果4. 1诱变菌株的生长情况图1诱变菌落生长情况，具体稀释倍数及诱变秒数如图中标记由图可见，未经诱变处理的平板菌落生长良好，按稀释梯度菌落数也呈现一 定规律；但本次实验并不成功，在经过诱变处理的平板中只有10-4生长出了菌 落，其余平板未见菌落，可能是由于该菌株过于敏感、紫外诱变时离紫外光源过 近所造成的，不太可能是实验失误（比如菌株在涂布的过程中被烫死、梯度稀释 时存在错误等原因，因为0s的菌株生长良好且符合规律）；10-4 60s平板的缺 失是由于最后一组做实验，期间因为事先准备的平板不够，没有涂布；10-6 30s 由于培养基高营养，无菌操作不当，染霉菌明显；10-6 60s的平板由于涂布时 平板没有凝固好（可能因为助教倒平板时没有摇晃，该平板琼脂含量过低没有凝 固好出现裂缝），故菌落生长在裂隙间。
致死率：10-4 30s： 1-（32X10-4）/（332X10-4）X100%=90.36%其余平板致死率均为100%4.2营养缺陷型筛选图2点板情况红框为本人实验结果点板实验实验结果较为理想，平板上纵列A意味本人代号为A, 1/2/3/4/5/6 依次为本人所挑的6个菌落A1A2A3A4A5A6YPD++++++SC+++---SC5++++++SC5-Ura+++---SC5-Lys++++++SC5-Leu+++---SC5-Trp+++---SC5-His+++---表1点板情况整理+意味着有菌落，-意味着无菌落5、实验结论本次营养缺陷型诱变实验，所得菌株A1/A2/A3均为非营养缺陷型，A4/A5/A6 为Ura、Lys、Leu、Trp、His的多重营养缺陷型6、思考题简答在营养缺陷型菌株筛选和鉴定过程中，将细胞接于无菌水中，室温静置2h的目的是什么？是为了对细胞进行饥饿处理，因为之前是生长在完全培养基上的，细胞内可 能有积累的生存所必须的酶、中间代谢产物等物质，饥饿处理使这些积累物质耗 尽，进而避免之前的完全培养基造成的影响；也起到将所挑取的单菌落进行稀释 的作用。