引物设计实例分析(GFP融合蛋白引物设计)引物设计基本原则引物长度(primer length)产物长度(product length)序列Tm值(melting temperature)G+C含量(composition)引物二聚体及发夹结构(duplex formation and hairpin)阅读框1. 引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp但不能大于38,因为过长会导致其 延 伸温度大于74c，即Taq酶的最适温度2. 产物的长度扩增片段长度为100~600碱基对3. Tm 值引物的Tm值一般控制在55-60度，尽可能保证上下游引物的Tm值一 致，一般不超过2度如果引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引 物长度稍长，而保证一定的退火温度Tm=2 (A+T) +4 (C+G)4. 引物的GC含量有效引物中(G+C)的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应上下 游引物的GC含量不能相差太大5.引物自身Plasmid 1：BamHISP [S/mBI Ml mcsJ I5G1-67UPlasmid 2FctfOIOSI138561pUCon■hsvtk i' pEGFP-N pcty A i>\郦'M kbSV40 QHGFPI ilAixbaii4i2iA^tW i Dra IG-H11lawlll (Ie?4I引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败任务BamHI(GGATCC)NRMaacgaccactt tgggactgac gcacggtgcc actggaacca481 541 601 661 721 781pcDNA3.1NRl的编码序列(~4000bp)121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg gg+cgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg c+gtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct ttt+tcctgc tcc+tcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagca+g aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttc+gtc acccacaagc ccaacgccat acaga+ggcc ctg+cag+gt g+gaggacct catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca cactcccacc cctgtctcct acacagctgg ct+ctacagc atccctgtcc tacccgaa+g tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gccctactcc caccag+cca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa红色为信号，焉太，蓝隹为BamHI番切位点，下划线标出盛切位点的阅读框GFP (-700bp)ATG&TGAGCAA& GGC&AGGAGCTSTTCACC6G 6&TGGT&CCC ATCCTGGTC6 A&CVGGACGG C6AC&TAAAC GGC^A^^A^A^GTTCAGCGTGTC C&&C6AG&&C 6A&G&C&A^& CCACCTACGG CA^A^^C^^A^^C C^^AA^&^^A T^^^^A^C^A^C CGSCAAGCTG CCCGT&CCCT GGCCCACCCT CG^&A^^^A^CC TT^GG^^A^CG GCCT&CAGTG CTTC&CCCGC TACCCCGACC A^CA^GAA^GCA GCACGACTTC TTCAAfiTCCG CCA^^^CCCGA AG&GVACGTC CAG&A&CGCA CCATCTTCTT CAA^^^A^C6A^C 6GCA^A^C^A^CA AQACCC&CGC CQA^GG^^A^A^& T^CGA^G^GC& ACACCCTG&T GAA^^GCA^C 6A&^T^6AA&G GCATCGACTT CAAG&AGGAC G&CAACATCC TGGG&CACAA GCT&GA6TAC AACTACAACA GCCACAAC&V CTATATCAT6 6C^GA^^A^A^GC AGA^&AACG& CATCAAGGTS AACTTCAA6A TCCGCCACAA CATC&AG&AC &6CA&C&TGC AGCTC&CC6A CCACTACCA& CA6AACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTTG CTGCT&CCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATTC ACATGGTTCCT SCTSGASTTC 6^GA^CCGCC6 CCG6GA^^CA^CTCTCS6CATS GA^C6A^GC^6T A^^AA^&TAA引物要求PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变 第一步：扩增GFP基本序列ATATGA&CAA&G&CGAQ&A&C &FP5’ ATG&T&AGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACG2CT&TACAAGTAA 3TACCACTCGTTCCCQCTCCTC& 石 5'变性.引物复….TCTCQGCAT^&AC&A &CTGTTACAAGTAA3' ...A&AGCC&TACCTGCTCGACATGTTCATTh PrinwZFrimtrl: aAT&aTGACCAA&&&CaAaAaC 3+ AACCACTCGT C6TACCTGCTCtfA£ATGTTCATl 5PrirtWrl： 5 AT>&A&CAAGa&C&A&GA&C PrifnsrZ： 5' TT4 CTTGT A CA &C^CG^CCA ^GCCGA GA……Prime『! S’ ATS 松 4&CAAAC&A&&A&C CTTGTA CA &CTC&TCCATGCC&A&A第二步：GC比值；Tm值Primerl: 5' ATGGTG A AGGGCG AGG A PHmerZ： 5* CTTGTACA&CTCGTCCATr&CC&AGA cttbtacabctcgtccatgcc 祐 C： 57%,Tnt 66】第三步：酶切位点Primerl: 5iBamHI: ggatccAT^GGT^&^&^^A^GGGC&A^&^GA(GC:60%,Tm：Primer2: 5*CVTI^V^^CA^GCT^CGT^CCA^T^&^CC 1(GC: 57%,A：Primerl: 5'9gQ^^QA^T^GGT^GA^GCAA^G&^6CGA^&^GAPrimer2: 5tggatccCTTfiTACAGCTCSTCCATGCCPHtnerl: 5- ATGGT&MC 阳 GGGCGAGG 昌(6C： 60%HTm= 64> PHm«r2* 炉64)66)第四步：阅读框N"序atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgctttt+tcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctg+c acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctglxag+gT gtgaggacct Primerl: 5' gggtcc4TGGT gagcaagggcgaggaIPrimerl; 55 atccTAT6GT6AGCAAGGGCGAGGA99otgagcaccatgcacctgc+gacattcgccctgc+tttttcctgctccttcgcccgc gcg gat ccc gaccccatig atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgeacgcatg aacagatgttccgcgaggca gtacaccagg ccaataagcg acacggctct tggaaga+oc agetcaacgixocttcfgix acccacaagc ccaacgccat acaga+ggcc ctgtcagtgt g+gcggacctGFP序列5t ATG6TG A GG&CGA &G A&C TCTC&GC ATG&AC&AGCTGTACA AGT A A 3t插AGFPJS的组合序ege gcg 吕 at ccT ..TCTCG6CATGGACGAGCT6TACAA& ??ggat ccc gaccccaag atcg+caacatcggcgcggt gc+g n£cci£： g cgcaagcatg aacaga+gt+ccgcgaggca gtaaaccagg ccaa+aagcg acacggctct tggaaga+ac agctcaacgccacttc+g+c acccacaagc ccaacgccct acagctggcc etgteag+gt gtgaggocct第五步保护序列Primerl: 5' GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2: 5' GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。
愣是写了一大段的PCR条件摸索的讨论后来PCR成为实验最基本的一步了，但是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方PCR的第一步就是引物设计了引物设计 需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都 是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计这个时候随机核苷酸 序列就与模板不是完全匹配我们通常指的设计引物都是在已知模板序列 的情况下进行设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率引物 分 析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平 衡设计引用有一些需要注意的基本原理：① 引物长度一般引物长度为18~30碱基总的说来，决定引物退火温度(Tm值)最重 要的因素就是引物的长度有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5 C在引物长度大于 20bp 时：62 3C +0.4「C(%G-C)-500/length-5 C另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因 此有时计算出的数值。
