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1、SCGE法检测DNA损伤SCGE的原理（中性电泳液，高盐和变性剂检测双链断裂；碱性检测单链，双链断裂和碱不稳定性）SCGE技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的方法。该技术的原理是基于有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。若细胞受损，在中
2、性电泳液(pH8)中，核DNA仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂(DSBs)时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液(pH13)中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。细胞核DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤
3、程度。1. 仪器及试剂冰箱，载玻片，水平电泳槽，荧光显微镜。不含Ca2+、Mg2+的PBS (PH=7.4)；正常溶点琼脂糖（NMA）及低溶点琼脂糖（LMA）（0.6溶于PBS）；细胞裂解液（2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1%肌氨酸钠, PH=10, 用前加1 TritonX-100, 10% 二甲亚砜（DMSO）；电泳缓冲液（0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA, PH=13）；0.4 M Tris-HCl（PH=7.5）； 无水乙醇；20-30g/mL 溴化乙锭（EB）。2. 方法1.在体外实验中,将对数期生长的细胞用0
4、.25%胰蛋白酶消化,收集细胞备用。在体内实验中,取需测试的脏器或组织,用磷酸缓冲液( PBS,PH 7.4) 洗净后,剪至糜状滴加PBS(PH 7.4) 研磨,过300 目筛子,收集细胞,悬浮于PBS(PH 7.4) 中, 细胞密度为（1-5） x 104-6个/ mL （血细胞计数板最中央每小格0.5个细胞）,台盼蓝染色、镜检、细胞存活率90 %以上,即可进行以下操作。 2.样品处理：1）通过尾动脉取血，肝素或枸椽酸钠抗凝，800r/min离心5min，加等体积无钙镁磷酸缓冲液，获得细胞悬液。a.枸椽酸钠抗凝:有2Na3C6H5O7。和2Na3C6H511H2O等多种晶体。通常用前者配成1
5、09mmol/l(32g/l)水溶液（也有用106mmol/l浓度），与血液按1：9或1：4比例使用。枸椽钠对凝血V因子有较好的保护作用。b.肝素（heparin）每毫升血液抗凝需要持素152.5Iu.c.EDTA盐经1000C烘干，抗凝作用不变，通常配成15g/L水溶液，每瓶0.4ml，干燥后可抗凝5ml血液。EDTA盐对红、白细胞形态影响很小.2）过氧化氢处理：细胞悬液分成两份:A份1ml； B份0.9ml。 B份里再加0.1ml 5mmol的过氧化氢，混匀。全部冰浴1小时。完后检测细胞存活率(台盼蓝染色、镜检)(过氧化氢处理用于检测DNA交联)。3）应用细胞悬液制备：4度下，1000r/
6、min离心5分钟。去上清，加PBS(PH 7.4)。每份制作2片凝胶。3. 制胶将载玻片用砂纸(粒度No. 380)磨出痕迹, 以便凝胶附着. 将37C正常溶点0.6琼脂糖液（溶于不含Ca2+、Mg2+的PBS，需要沸水加热）75-100l铺展到预热的磨痕载玻片上，作为第一层凝胶，盖上盖玻片4凝固10分钟以上, 去掉盖玻片后加入制备的细胞悬液85l(10l含1000 个细胞的PBS和75l 0.6%的低熔点琼脂糖(LMA) 在37混匀)铺展到载玻片上作为第二层, 4至少10分钟, 凝固后再铺展低溶点0.6琼脂糖100l作为第三层, 使载玻片上琼脂糖呈“三夹层”式.（注意：NMA 适宜浓度0.
7、5 %1 % ,过高或过低将造成凝固速度过快而不易铺平或粘着力低而脱落,铺胶前载玻片预热,有利于铺植平整。LMA 凝胶浓度直接关系到DNA 迁移长度 ,0. 6 % 较适宜。第3 层LMA 可不铺。微量加样器吸头前端残留凝胶勿吹出,以防形成气泡。移去盖玻片时注意勿损伤胶膜）4. 裂解4凝固后去掉盖玻片，将载玻片浸人新配制的4预冷细胞裂解液（含2.5M NaCl, 100mM Na2EDTA, 10mM Tris-HCl(PH=10)，用前加1 TritonX-100, 10% 二甲亚砜（DMSO），裂解不少于1h。此步骤的目的即是溶解细胞膜及核膜,除去蛋白质、RNA 等,仅存留核骨架。5. 电
8、泳裂解后将玻片晾干，并列置于水平电泳槽的阳极端，电泳缓冲液(0.3M NaOH、1mM EDTA)盖过胶面约2.5mm，静置20-60min解链。之后接通电源，电泳条件25V，300mA，时间20-40分钟。通过调节液面来调电压。(电压先调到最大，电流300mA然后通过液面来调节电压)。（注意：电泳时电压、电流及时间的长短会直接影响DNA 迁移长度,造成假阳性或假阴性。文献报道为1850 V ,200300 mA ,2040 min。我们采用25 V ,300 mA ,20min ,效果良好。电泳进行中应持续监测,吸出或加入电泳液,调节液面高度,保持电压与电流的恒定）6，染色电泳结束后，用0.
9、4 M Tris-HCl (PH7.5) 洗涤三次，每次5分钟，呈中性后，凉干玻片，(无水乙醇处理30分钟可增加荧光强度) 每片滴加50l 20-30gml的EB染色1520min，然后用蒸馏水洗滴，盖上盖玻片在荧光显微镜下观察。24小时内检测，时间过长将导致荧光褪色。（注意：可在染色后4 避光潮湿条件下保存,数日后观察。但我们通过实践得出为防止荧光衰减,尽快阅片较好。阅片过程中,由于淬灭效应,荧光减弱很快,因此操作必须紧凑。结果可直接在荧光显微镜下分析,或先摄影,再进行照片分析。但摄影、相片冲洗条件等较难控制统一,因此应尽量直接分析）以上除中和及染色外，各步均应在暗处进行，以避免额外的DNA
10、损伤。应尽快阅片，时间过长将导致荧光褪色。6观察使用100W汞灯作为荧光光源，在荧光显微镜（激发波长为549nm,发射波长为590nm）下，损伤的细胞DNA呈现由圆形、致密红色核心（慧头）和朝向阳极的尾端DNA碎片（慧尾）构成的“慧星”。本实验选用DNA断裂分级和DNA慧星尾长两种观察指标。DNA断裂分级按慧星尾部占全部DNA量的比例判断。0级：无断裂级损伤；A级：轻度断裂损伤，断裂损伤10%；B级：中度断裂损伤，断裂损伤10%-20%；C级：重度断裂损伤，断裂损伤60% “慧星”,每片随机计数50个“慧星”，计算各级所占比例。DNA慧星尾长是在高倍镜下直接测量出“慧头”中心到“慧尾”的长度(
11、格数)。每片随机测量25个“慧星”尾长,计算均数。7统计分析：应用SPSS软件分别对彗星尾长和断裂进行方差分析和卡平方检验。表一：编号DNA断裂损伤分级0ABCD表二：编号尾长头直径下降率预期结果：污染越严重，随着DNA链受损程度越大, 出现慧尾的细胞数越多，慧星尾中的DNA含量及尾长也就增加。单细胞凝胶电泳技术在军事毒理学中的应用作者：张慧丽 余卫 闫长会2003-9-2由Ostling和Jonhanson首先提出，后又经Singh和Olive建立和改进的单细胞凝胶电泳(Single Cell Gel Electrophoresis，简称SCGE)技术，因其细胞电泳形状颇似慧星，又称慧星试验
12、(Comet Assay)。它是一种测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术，与传统方法相比，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记，具有极高的实用价值。该技术可用于体内、体外各种实验，目前已广泛地应用于各种有核细胞经受试物诱导的DNA损伤和修复的研究。在国外，SCGE被用于遗传毒理学、放射生物学、环境生物监测、药物筛选、肿瘤发病机理及诊断与治疗、衰老和细胞凋亡机制的研究等，正在形成一个新的研究领域，有关应用该技术的报告也是逐年增加1，2。然而，国内关于该技术的研究报告仅有几篇。本文就该技术的原理、操作程序和方法作一简介，并预测其在军事毒理学研究中将有广阔的应用前景。 1 SCGE的原
13、理SCGE技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的方法。该技术的原理是基于有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。若细胞受损，在中性电泳液(pH8)中，核DNA仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有
14、当DNA双链断裂(DSBs)时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液(pH13)中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。细胞核DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。2 SCGE实验程序和方法至今，SCGE技术在世界上许多实验室应用，操作上进行了许多改良，并不断地融进新技术，如荧光原位杂交彗星试验3等。但是，最常用的还是碱性SCGE方法，其基本操作程序如下：2.1 处理因素 如今已有70多种处理因素，简要概括为：辐射因素(X射线，60Co、137Cs、125I等发出的射线，
