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1、绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（reen furecentprotin,GF）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白.当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GF 由3 个外显子组成，长26b；是由238个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为2。 0Mr，其蛋白性质十分稳定,能耐受60处理.196 年GP 的晶体结构被解出,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长42 m,宽40 nm，由1个围绕中心螺旋的反平行折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 个短的垂直片段
2、覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第6-67位的er-Tr-Gly自身环化和氧化形成。实验一质粒DNA的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒DNA提取方法：碱裂解法。该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时,提取的质粒NA质量较高，可用于DNA的酶切、PC甚至测序。二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外,能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止,从细菌中分离得到的质粒都是环型双链D分子，分子量范围从1k到200kb。质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体
3、上，随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝,称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒,它们在每个细胞中的数目可达10200个拷贝。当宿主细胞的蛋白质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒N可继续被复制,以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记,当质粒DN用人为的方法转化进细菌时,转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，
4、例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取,它们都包括三个基本的步骤:细菌的生长和质粒的扩增;菌体的收集裂解,质粒NA的分离；质粒DA的纯化。1、 细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒(如pUC系列)来说，只要将培养物放到标准的LB或Y培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒,而不必选择
5、性地扩增质粒DA。但对于严谨型质粒（如R32）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时,以便对质粒进行选择性扩增。2、菌体的收集、裂解和质粒DN的分离质粒分离的基本原理是利用宿主菌(一般是大肠杆菌菌株）N与质粒DNA之间的两种主要性质差异：(1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。(2）从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒NA是共价闭合的环状分子。这里主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入SDS(十二烷基硫酸钠)和NH使菌体裂解(有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体DA变性，但闭环
6、质粒DN链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开.当条件恢复正常时（如加入酸性的ac或Kc中和碱性NaOH）,质粒A链迅速得到准确配对,重新恢复成天然的超螺旋分子。通过离心,可以使染色体D与变性蛋白质、NA分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。3、质粒D的提纯对于小量制备的质粒NA，经过苯酚抽提、RN酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白质及RN,达到纯化的目的。质粒DN分子具有三种构型：共价闭合环形DN（ccDNA，SC构型)、开环A（OC构型)和线性分子（L构型）。在细菌体内,质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA,尽管分子量相同，但具有不同
7、的电泳迁移率。其中走在最前沿的是C DNA,其后依次是L DNA和O DNA.三、实验材料、仪器及试剂1。 在含有pEFPN3质粒的H5平板上菌落上挑取菌种，置于含有5mL L培养基的试管中.摇晃过夜。在含有pE8质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜。2、使用仪器 恒温培养箱,超净台,恒温摇床，制冰机，台式离心机,小型混合器，冰箱四、实验步骤1. 取.l H培养液倒入。mL pndr 管中,13000rm离心in.2. 重复1.3. 弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。 4. 菌体沉淀重悬浮于10L溶液中(需剧烈振荡),室温下放置10i。 5. 加入新配制的溶液2
8、0l, 盖紧管口,快速温和颠倒ppenorf 管次，以混匀内容物（千万不要振荡)，冰浴5in。6. 加入50L预冷的溶液，盖紧管口，并倒置离心管,温和振荡3次,使沉淀混匀,冰浴中1分钟，13000rpm离心min。 7. 上清液移入干净eppeorf管中,加入等体积的氯仿异戊醇（2：1），振荡混匀,3000rpm离心min. 8. 将水相移入干净eppedorf 管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)振荡混匀，1300pm离心2。 9. 将水相移入干净ppendorf 管中,加入 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后,置于室温下mn,然后13000m离心5in。 10. 弃上清，将管口敞开倒置于卫
9、生纸上使所有液体流出,加入1mL 0乙醇洗沉淀一次,振荡混匀后，100p离心5min。 11. 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。 12. 将沉淀溶于0 T缓冲液(pH8。0,含0mL RNseA）中，保存在20冰箱中。 13. 按照同样的流程和方法将pT-28的质粒也提出来,保存在20冰箱中。五、实验结果实验二 质粒DNA浓度的测定一、实验目的学习利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度.二、基本原理核酸分子在26n下有最大吸光值,因此可以通过260nm下核酸的吸光值计算核酸浓度（g/l）,并通过测定与280nm和230m的比值，估算DA的纯度.三、实验材料与仪器1、实验材料
10、pEGP3和pE-28a DA2。使用仪器pedr核酸蛋白测定仪，移液枪四、实验步骤1. 按下Eppenrf核酸蛋白测定仪DNA，比色皿中加入0H2O，blan空白对照。2. 取一0.5ml离心管，吸取质粒NA 5l,然后再加入95l ddH，混匀。3. 将100l的溶液转移到比色皿中,注意不要出现气泡。4. 按下smpl,记录260n下NA的浓度（m/ml）。并同时记录OD26nm/28nm,O20/30nm的比值,估测DNA的纯度。5. 计算质粒DA母液的浓度=D20nm下的浓度0（gml），DA的纯度：OD2nm280m=1。01(如果低于1.7，说明样品中蛋白质去除的不完全，或样品中有
11、苯酚的污染；如果高于.9,说明样品中RNA去除的不完全.) OD60nm/230nm 2.0实验三 琼脂糖凝胶电泳一、实验目的学习掌握一种最常用的分离、鉴定、纯化NA片段的比较方便、省时的技术：琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法.二、基本原理影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：（1）NA分子的大小 双链NA分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大,迁移的越慢，因为摩擦阻力越大,也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。（)琼脂糖浓度 给定大小的线状DN片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在NA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度之间存在线性相关.(3)D的构
12、象 超螺旋环状(型）、切口环状(型)和线状（型）D在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移.其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型,其次是电流强度、缓冲液离子强度和型超螺旋绞紧的程度或密度。一些条件下，型DN比型迁移得快；在另一些条件下，顺序可能相反。(4）所用的电压 低电压时,DNA片段迁移率与所用的电压成正比。电场强度升高时,高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。要获得大于kbDA片段的良好分辨率,所用电压不应高于-V/c。（5）电泳缓冲液 NA的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响.缺乏离子则电导率降低,DNA或者不动或者迁移很慢。高离子
13、强度时(如bufe)，电导率升高，使得应用适中的电压也会产生大量的热能,最严重时凝胶会熔化，DNA变性。三、实验材料、仪器及试剂1、实验材料质粒2、使用仪器核酸电泳仪，小型混合器，冰箱,蓝盾可见光透射仪四、实验步骤1、 1琼脂糖凝胶的配制(1）加0mlE缓冲液于三角瓶中，()精确称取02g琼脂糖加到三角瓶中,于微波炉中加热至完全熔化,()冷却至60左右，()轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却0分钟以上,()将胶板除去封胶带,放入电泳缓冲液（TBE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1m，轻轻拔除梳子，（6)取5l质粒NA及GeeFinder混匀上样(7)50-00v约电泳0。5-1小
14、时（8）蓝盾可见光透射仪观察结果。五、实验结果实验四 酶切及连接1. 实验目的学习使用限制型内切酶进行DNA酶切的原理和方法。2 实验原理迄今已发现了300多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。I型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DN链。它们产生确定的限制片段,因此是三类限制性内切酶中唯一用于NA分析和克隆的一类。5GAATTC33CTTAAG-5II型限制性内切酶中最普遍的是象EcRI、n III、BamH和Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分.大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DN上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上,识别非对称序列。一些酶识别连续的序列(如cR I识别GAATC；Hi II识别AAGCT；amHI识别GGATCC；Nt I识别GCGCCGC);而另一些识别不连续的序列（如BglI识别GCCNNGC)。限制性内切酶酶切DNA后形成两种类型的末端：（i)两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末端，如EoR I酶切后产生末端;（ii)两条链的断裂位置处在一个对称结构5-GCC33CCGG5。的中心，产生平末端，如aeIII酶切后产生NA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二
