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1、天长天康医院检验科工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第1页共26页编写者：熊静静审核者：夏清批准人：胡军生效日期：2020. 8.10文件发放范围：微生物组文件年度审核审核者：审核者：审核者：审核者：日期：日期：日期：日期：抗菌药物敏感性试验流程1.目的：抗菌药物敏感性试验（药敏试验）的主要目的是检出细菌的耐药性，预测抗菌药 物的临床治疗效果，并为临床医生针对某一特定的临床感染问题选用药物提供依据。2. 适用范围微生物实验室所有标本，环境。3. 职责范围微生物实验室各工作人员。4. 药敏试验的一般规则4.1 对任何感染的可疑病原菌，若不能从该菌的种属特征可靠地
2、推知其对抗菌药物的敏感 性，就需要进行药敏试验。如果感染是由公认的对某一高效药物敏感的微生物引起，常规不 需要进行药敏试验，见附录6技术说明（1）。4.2 同一患者连续分离培养出的同一种细菌，若最初药敏试验显示为敏感株，随后临床出现 可疑的耐药表现，需重复进行药敏试验，见附录6 技术说明（2）。4.3 进行细菌耐药性调查和抗生素疗效评估时需进行药敏试验。4.4 除临床急症细菌学检查标本，并经直接涂片染色证实为单一致病菌外，一般不主张用临 床标本直接做药敏试验。直接标本做药敏试验后，必须按标准方法重做一次。4.5 当感染的性质不清楚、标本内含数种混合生长的细菌或正常菌群，而且这些细菌与感染 的关
3、系很小时，通常不必做药敏试验。5. 常规药敏试验药物选择原则5.1 选择适合的药物进行药敏试验一般应由临床微生物检验医师与感染科医师、药剂科、医 院药事委员会和医院感染委员会成员共同协商作出决定。在选择抗菌药物时应考虑以下因 素：工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第2页共26页5.1.1一般情况下，药敏试验所选用的抗菌药物应包含于本单位的处方手册中。 5.1.2临床微生物实验室所服务的医疗机构的类型、规模及患者的构成不同，其所分离细菌 的耐药谱不同，药敏试验的药物选择不同。5.1.3菌种类型不同，药敏试验的药物选择不同。5.2我国目前主要依照美国国家临床实验室
4、标准化委员会（NCCLS） /临床实验室标准化研 究所（CLSI）所制定的药敏试验执行标准作为选药指南（见附录12）。该指南针对每一菌 群所推荐的药物都具有确切的临床疗效，其体外试验结果也可以接受。在附录12表内小格 中的列出个小框中列出的一群类似药物，由于它们的解释结果和临床效力都很相似，因此不 必每个都进行试验。另外，用“或”字表示的一群相关的药物，其抗菌谱和结果解释几乎完 全相同，其交叉耐药性和交叉敏感性也几乎完全相同。因此，通常每个小框（组或相关的群） 中只选择一种药物进行试验。5.3 NCCLS文件每年都有补充和更新，为了保证药敏试验的正确性和对临床的指导性，进 行药敏试验时应依照最
5、新版本（本规范中提供的是2005年修订的第十五版）。6. 药敏试验方法6.1 纸片扩散法6.1.1抗菌药物纸片：一般应购买合格的商品化的药敏纸片进行试验，药敏纸片的贮存见附 录6技术说明（3） 。6.1.2琼脂培养基 非苛养菌的常规药敏试验使用MH （Mueller-Hinton）琼脂，其制备、 贮存和使用方法见附录6技术说明（4） 。6.1.3菌悬液的浊度标准 使用0.5麦氏（McFarland）标准管，见附录6技术说明（5）。6. 1. 4纸片扩散法的操作6.1.4.1接种物的制备6.1.4.1.1生长法：从琼脂平板上选取至少35个形态特征一致的菌落，用接种环接触每 个菌落顶部后将细菌转移
6、到含45 ml适宜的肉汤培养管（如胰酶消化大豆肉汤）中，将此 肉汤培养物置35C孵育至其浊度等于或超过0.5麦氏标准（通常需26小时）。用无菌盐 水或肉汤将旺盛生长的肉汤培养基的浊度调整到相当于0.5麦氏标准，细菌数约为12X108 CFU/ ml。工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第3页共26页6.1.4.1.2直接菌悬液法：从孵育1824h的非选择性培养基（如血琼脂）平板上，挑取单 个菌落，直接用肉汤或盐水制成悬液作为接种物，然后将浊度调整至0.5麦氏标准。此法是 检测苛养菌（如嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌和链球菌）和潜在的对甲氧西林耐药的葡萄球菌的 推荐方法，
7、见附录6技术说明（6） 。6.1.4.2接种应在菌悬液制备后15分钟内接种MH琼脂平板。用无菌棉拭蘸取菌液，在管内壁液面上方旋 转紧压，将多余菌液挤去，然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度以确保 接种菌的均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。6. 1. 4. 3贴药敏纸片接种好的平板可敞开盖子倒置在室温下干燥35min,在15min之内用纸片分配器或无菌镊 子将纸片贴于琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完全接触。各纸片中心相距应大于24mm, 通常直径150 mm平板至多贴12个纸片，直径90100 mm平板至多贴6-7个纸片。某些药 物在纸片贴于琼脂平板后几乎立即扩散，一旦纸片贴上后
8、就不能再移动，若要重新放置，可 用一个新的纸片贴在平板的另一位置。6.1.4.4孵育：纸片贴好后，15min内将平板倒置放入35C孵箱（苛养菌药敏平板应放置 于5%C02环境中）1618h后读取结果，见附录6技术说明（7）。葡萄球菌和肠球菌必 须孵育整24h以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。6.1.4.5结果判读：抑菌圈呈透明圆环状，菌苔生长的平面应该是均匀连续的，如出现明显 的单个菌落生长说明接种菌的浓度太低，应重新进行试验。抑菌圈的直径（包含纸片的直径）， 以毫米数报告（取整数），见附录6技术说明（8）。对某些细菌抑菌圈的判读有特殊要求6. 1. 4. 5. 1检测苯唑西林和万古霉素对葡
9、萄球菌或肠球菌的抑菌圈需要用透射光（将平板对 着光线）。抑菌圈的边缘应不见细菌的明显生长，若只有用放大镜才可发现的微弱生长的细 小菌落则可以忽略。）检测葡萄球菌或肠球菌时，在苯唑西林纸片（葡萄球菌）或万古霉素 纸片（肠球菌）周围的抑菌圈内有任何可辨的菌落或生长薄膜（包括针尖样菌落）则提示耐 药。6.1.4.5.2对其他细菌，若在清楚的抑菌圈内有独立的菌落生长，则提示可能接种的菌种不工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第4页共26页纯，需要重新分离、鉴定和药敏试验，但此菌落也可能为抗菌药物选择出的高频突变耐药株。6.1.4.5.3 变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌
10、药物的抑菌圈内，所以在明显的抑菌圈内有 薄膜样爬行生长可以忽略。6.1.4.5.4 对于链球菌应检测生长抑制圈而不是溶血抑制圈。对于甲氧苄啶和磺胺，拮抗物 可使细菌轻微生长（生长菌苔的 20%或以下），所以抑菌圈直径的检测应不考虑细微生长的 部分而测量比较明显的边缘。纸片扩散法操作流程及某些特殊细菌的药敏试验要求见附录4、5。6.2 稀释法：稀释法药敏试验可用于定量测试抗菌药物对细菌的体外活性，分为琼脂稀释法 和肉汤稀释法。试验时抗菌药物的浓度通常经过倍比（log2）系列稀释，能抑制待测菌肉眼 可见生长的最低药物浓度称为最小抑菌浓度（MIC）。一个特定抗菌药物的测试浓度范围应包 含能够检测细菌
11、的解释性折点（敏感、中介和耐药）的浓度，同时也应包含质控参考菌株的 MIC。稀释法是标准药敏试验的参考方法，但因操作烦琐，不易在常规工作中开展，常用于 临床药理研究和方法学的评价。在稀释法中一般常使用微量稀释法（可与自动微生物分析仪 配套使用），其方法如下：6.2.1 肉汤稀释（常量）法6.2.1.1使用无菌的13X100mm试管，每一浓度抗菌药物的量至少为lml,通常为2ml。6.2.1.2推荐使用Mueller-Hinton （MH）肉汤，在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%NaCl （w/v）, MH肉汤按制造厂家的要求制备。6.2.1.3 抗菌药物的制备、贮存和稀释：
12、药物来源用使用抗菌药物标准品或参考药粉，而不 应该使用胃肠道用的制品，对所用的抗菌药物都应分析其标准活力单位，称取药物时应使用 校正过的分析天平，用准确称取的抗菌药物配制母液，母液浓度至少应为1000 g/ml，或者 是最高测试浓度的10倍，少量的母液可分装于无菌的小瓶中，仔细密封后贮存于-60C或更 低，小瓶可以按需要融化并在当天使用，药物的稀释见附录 6技术说明（9）。为减少抗 菌药物的蒸发和变质，试管应盖紧并于4C8C保存，稀释好的抗菌药物溶液应在5天内 使用。6.2.1.4 接种物的准备和接种6.2.1.4.1汤稀释法推荐的接种物最终接种浓度为5X105CFU/mLo首先通过生长法或直
13、接菌工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：1.0页码：第5页共26页落悬液法制成浊度为0.5McFarland标准的菌液，用肉汤将上述菌液进行1: 100稀释（106CFU/ ml）,分别取1 mL接种物，加入装有1 mL抗菌药物肉汤稀释液的各支试管和一支不含抗菌 药物的生长质控管中，并将每个试管混匀，这样每个抗菌药物浓度都被1:2稀释，菌液浓 度为5X105CFU/ ml。见附录6技术说明（10）。6.2.1.4.2按规定配制的菌液应在15分钟内接种，并取一份接种菌液在非选择琼脂平皿上 传代培养，以检查接种物的纯度。6.2.1.5孵育：接种好的常量稀释管应放在35C普通空气
14、孵箱中孵育1620h,当测试嗜血 杆菌和淋病奈瑟菌时，应在5%的C02中孵育2024小时，对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和 耐万古霉素的肠球菌孵育应持续整24小时。6.2.1.6结果判读 在读取和报告所测菌株的MIC前，应检测生长质控管或孔（不含抗菌药 物）的细菌生长情况，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否被污染及接种量是 否合适，质控菌株的MIC值应处于合适的质控范围。生长终点的判读可通过含有抗菌药物的 管与生长质控管的比较来进行，通常细菌的生长可通过可见的浊度、一个直径场mm的沉淀 菌斑或多个小菌斑来显示，能抑制细菌生长的最低抗菌药物浓度为该抗菌药物对被测菌的 MIC。见附录6 技术
15、说明（11）。6.2.2肉汤稀释（微量）法：操作方法同常量法。多用商品试剂并与自动仪器配套，详见供 应商的产品说明书。自制的含药微量稀释盘应用塑料袋密封包装并立即置于W-20C（最好 W-60C ）保存至需要时，在-20C大多数抗菌药物可保存至少6周，但某些不稳定的抗菌药 物除外，如亚胺培南、头孢克洛、克拉维酸等。解冻的抗菌药物溶液不能重新冷冻，因反复 冻融会加速某些抗菌药物，特别是B-内酰胺类的降解。7. 几种重要耐药菌的监测7.1肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌中ESBLs检测的筛选与确证 试验工作流程文件编号：TKYYLS1-106-2020版本：i.o页码：第6页共26页表1肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌中ESBLs检测的筛选与确证试验方法初步筛选试验表型确证试验咖氓甘 培养基Mueller-Hinton 琼月旨Mueller-Hinton 琼月旨抗菌药物纸片浓度头抱泊肟10ug或头抱他啶30 ug或氨曲南30ug或头抱噻肟30 ug或头抱曲松30ug（使用一种以上的药物进行筛选将会提高检测的敏感性）头抱他啶30 u g头抱他啶/克拉维酸30/10 u g
