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1、G-LISA法：高效快捷的小G蛋白活化检测方案基础知识背景一什么是小G蛋白？小G蛋白(Small G Protein)因分子量只有2030KD而得名，同时具有GTP酶活性，小 G蛋白家族成员在细胞信号通路中发挥分子开关的功能，参与调控很多生物学过程。小G蛋 白的共同特点是，当结合了 GTP时即成为活化形式，这时可作用于下游分子使之活化，而当 GTP水解成为GDP时(自身为GTP酶)则恢复到非活化状态。这一点与G蛋白里的Ga类似， 但是小G蛋白的分子量明显低于Ga。在细胞中存在着一些专门控制小G蛋白活性的小G蛋 白调节因子，有的可以增强小G蛋白的活性，如鸟苷酸交换因子(guanine nucle
2、otide exchange factor, GEF)和鸟苷酸解离抑制因子(Guanine nucleotide dissociation Inhibitor, GDI)，有的可以降低小G蛋白活性，如GTP酶活化蛋白(GTPase activating protein, GAP)。EffeccorGDISmall GGDPInactiveActive(；【卩 GEFFiirncsyl orSmall G .GTP Small （；GTPGAPs第一个被发现的小G蛋白是Ras，它是Ras基因的产物。小G蛋白的Ras超家族由超过 150个成员组成，基于它们的序列同源性，被分成若干亚家族，例如Rho
3、, Ras，Ran，Rab， Arf 和 Rad / Rem / Gem / Kir。小G蛋白超家族成员及其相关功能:亚家族功能成员Ras细胞增殖DIRAS1; DIRAS2; DIRAS3; ERAS; GEM; HRAS; KRAS; MRA S; NKIRAS1; NKIRAS2; NRAS; RALA; RALB; RAP1A; RAP1 B; RAP2A; RAP2B; RAP2C; RASD1; RASD2; RASL10A; RAS L10B; RASL11A; RASL11B; RASL12; REM1; REM2; RERG; RERGL; RRAD; RRAS; RRAS2
4、Rho细胞骨架的 动力与形态RHOA; RHOB; RH0BTB1; RH0BTB2; RH0BTB3; RHOC; RHOD;RHOF; RHOG; RHOH; RHOJ; RHOQ; RHOU; RHOV; RND1;RND2; RND3; RAC1; RAC2; RAC3; CDC42Rab膜转运RAB1A; RAB1B; RAB2;RAB3A;RAB3B;RAB3C;RAB3D;RAB4A; RAB4B;RAB5A;RAB5B;RAB5C;RAB6A;RAB6B; RAB6C; RAB7A;RAB7B;RAB7L1;RAB8A;RAB8B;RAB9; RAB9B; RABL2A;RAB
5、L2B;RABL4;RAB10;RAB11A;RAB11B; RAB12; RAB13; RAB14;RAB15;RAB17;RAB18;RAB19;RAB20; RAB21; RAB22A;RAB23;RAB24;RAB25;RAB26;RAB27A; RAB27B; RAB28; RAB2B; RAB30; RAB31; RAB32; R AB33A; RAB33B; RAB34; RAB35; RAB36; RAB37; RAB38;RAB39; RAB39B; RAB40A; RAB40AL; RAB40B; RAB40C; RAB 41; RAB42; RAB43Rap细胞粘附RAP
6、1A; RAP1B; RAP2A; RAP2B; RAP2CArf囊泡转运ARF1; ARF3; ARF4;ARF5;ARF6;ARL1;ARL2;ARL3; ARL4; ARL5; ARL5C;ARL6;ARL7;ARL8;ARL9;ARL10A;ARL10B; ARL10C; ARL11; ARL13A; ARL13B; ARL14; ARL 15; ARL16; ARL17; TRIM23, ARL4D; ARFRP1; ARL13BRan核运输RANRhebmTOR途径RHEB; RHEBL1RGKRRAD; GEM; REM; REM2RitRIT1; RIT2Miro线粒体转运RH
7、OT1; RHOT2Ras蛋白主要参与细胞增殖和信号转导；ho蛋白对细胞骨架网络的构成发挥调节作用； Rab蛋白则参与调控细胞内膜交通(membrane traffic),其他家族成员也在细胞信号通路 中发挥着非常重要的作用。因此，研究GTP酶(GTPase)的活化调控机制具有广泛而深远的生物学意义。传统检测 Rho蛋白活化水平的方法主要为pull-down检测。pull-down法往往存在耗时长、需要样本 量大、不太适合高通量检测等缺点。为克服传统方法这些方面的缺点，Cytoskeleton公司 开发了新一代的G-LISA检测方法，用于快速简便地检测GTP酶活化水平。containlrgac
8、tive (6TP bound) and inaclive JGDP bound) GTPeise added to swells Lasted 脑thca pture proteinantbGTPase aintibadyc3xzPciplg of GLISA 佔血丫CfTV)Wells are va&hed vdih buffer to renio the unbound proteinG-LISA实验原理及操作步骤Ajctrvebind 1:0 up仙rE procelnHRP-econdary jtibody is added, binding to antl-GTRase prima
9、ry anilbodvwiiile inactive GTPases remain unbourdAn anti-GTPa&e antibody is added that splflcall recognizes the bound GTPa1首先将效应蛋白的受体结合域（RBD）包被96孔板；2. 样本中GTP（活化状态）结合形式的蛋白分子则可结合到板上，而GDP（无活性状态）结合形 式蛋白则不结合；3. 洗去未结合的蛋白；4. 然后依次加入特异性的一抗和HRP-二抗进行孵育结合；5. 最后利用合适的酶底物OPD或化学发光试剂显色。Legend： Rhoactivation (left) a
10、nd Racactivatjon fright in Swiss 3T3cekSwiss 3T3细胞中，Activators活化的Rho蛋白（左）和Rac蛋白（右）传统Pull down法和G-LISA法的比较传统Pull down法G-LISA用包被效应蛋白的亲和磁珠选择性用包被效应蛋白的96孔板选择性的原理的结合有活性的GTPase，用结合有活性的GTPasewestern blot检测信号用ELISA检测信号实验设备SDS-PAGE、Wes tern blot 相关仪器ELISA相关仪器上样量300 - 2000 Ag per assay5 - 50 Ag per assay样品数量Up
11、 to 10 samplesUp to 96 samples (or more)WB具有很窄的线性范围。此外，样结果定量品的多次操作也会导致某种程度上提供精确定量的数字读数的变异分析。反应时间10-12hV3h对比视频网址https:/ down，主要有操作简便、上样量少、可同时检测多个样本、 反应时间短、定量结果准确、与小鼠、大鼠和人的组织和细胞兼容等优势。Pull-down实验结果展示：Pull-down Result ExampleLanes4 & 5:10 ng/ ml of EGF,LanesLanes2 & 3: Persistent serum starvation 1: 20
12、ng of recombinant Rac1-His protein run as a western blot standardG-LISA实验结果展示:G-LISA Result ExampleTime (min)5 5 4 5 3 5 2 .斗D.3D.2D. o o o-Euos 寸 CKlhBLJBiAEnu.yEpoms.IZZlC/73R C/n3 卜Construct； GFPCdc42 DN-Cdo42 ARHGAP21 .5.0.5 善寻匸逗京soO.O-Construct:Figure 7. TheWT GAP21 WT GFP GAP21impact of ARHGAP
13、21 overexpression on endocytosis.(A) Cln3-/- and Cln3R MBECs were transfected with GFP, WT-Cdc42, dominant negative Cdc42 (DN-Cdc42), or ARHGAP21 expressing plasmids and Cdc42-GTP levels measured. (B) MBECs were transfected with GFP negative control, WT-Cdc42, or ARHGAP21(GAP21) constructs and rhoda
14、mine-conjugated dextran uptake was assessed as in Fig. 2. Results represent the mean of three independent experiments.A1 ,5nfro-Cln3R Cfn3A0,0Arf1ActiinCin3R Cln3 0 5 0.1 o o -augc- pu1HFigure8. ARF1-GTP is reduced in CLN3-null MBECs.(A) ARF1-GTP levels were quantified in Cln3R and Cln3-/- MBEC lysates. (B) TotalARF1 protein levels were quantified in Cln3R an
