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1、一、植物基因组 DNA 提取【实验目的】掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和 改良植物总 DNA 抽提方法。【实验原理】 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶 类（尤其是氧化酶类）对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧 化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于 破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠（sarkosyl）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为 CTAB）、十二烷基硫酸钠（sodium dode
2、cyl sulfate， 简称SDS）等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从 而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使 抽提液分相，因核酸（DNA、RNA）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞 碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶 液中，即得植物总DNA溶液。【仪器、材料、试剂】（ 一 ） 仪器1高速离心机2烘箱3冰箱4水浴锅5. 高压灭菌锅（二）材料1. 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）2. 三羟甲基氨基甲烷（Tris）3. 乙二胺四乙酸（EDTA）4. 氯化钠52-巯基乙醇6. 无水乙醇7.
3、氯仿8. 异戊醇（三）试剂1. CTAB抽提缓冲溶液：250ml配制方法：称取CTAB 4g,放入200 ml的烧杯，加入5 ml的无水乙醇，再加入 100ml的三蒸水，加热溶解，再依次假如56 ml的5moll NaCl、20 ml的1 moll Tris-HCl 20ml（ PH8.0）、8ml 的 0.5 mol/l EDTA 定容至 250 ml 摇匀后，转到 准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，冷却后加入2ml的1% 2- 巯基乙醇（400ul）, 4C保存。2. 氯仿：异戊醇=24：1（配制方法如实验二）3. TE缓冲液：PH8.0 （配制方法如实验二）【实验步骤】（
4、一）DNA的提取1. 2%CTAB抽提缓冲液在65C水浴中预热；2. 取少量叶片置于试管中，用小杵磨至粉状；3. 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀；4. 置于65C的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；5. 冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24:1）至满管，振荡23 min，使两者混 合均匀；6. 10000 rpm离心10 min，与此同时，将600卩l的异丙醇加入另一新的灭菌 离心管中；7. 10000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离 心管内，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能见到D
5、NA絮 状物；8. 10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出9. 加入800卩l 75%的乙醇，将DNA洗涤30 min；10. 10000 rpm离心30s 后,立即倒掉液体，干燥DNA （自然风干或用风筒吹干）；11. 加入50 p l 0.5 X TE缓冲液，使DNA溶解；12. 置于-20C保存、备用。【注意事项】1. 叶片磨得越细越好。2. 注意移液器的正确使用。3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的 活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶, 使 DNA 降解。二、植物基因组D
6、NA提取、酶切及电泳分析（一）、目的掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。大分子量DNA分子的酶切分析。（二）、原理 十六烷基三乙基溴化胺是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、 多糖类物质分开，然后将 CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加乙醇 使核酸沉淀， CTAB 能溶解于乙醇。（三）、试剂与器材1、试剂（ 1）、 DNA extraction ：500ml31.885g sorbitol
7、 （山梨醇）6.05g tris PH8.2（一般不调）（ 2）、 Nuclei lysis buffer: 500ml100ml1M Tris PH7.5100ml0.25M EDTA200ml5MNaCl10gCTAB100mlddH2O2（3）、5% sarkosyl （N-月桂酰肌氨基钠盐）500ml用时，将上述三种溶液按1： 1： 0.4比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/l）, 65C预热，既为抽提液。2、器材恒温水浴、研钵、电泳设备（四）、操作步骤1、基因组DNA提取（1）取0.15g左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中，加入700 l 抽体液（65C预热）混匀，放
8、入65C水浴中，裂解40-60分钟，期间温和混匀 几次。（2）取出裂解好的DNA，加入700 l氯仿：异戊醇（24： 1）,猛烈混匀，离 心（lOOOrpm, 10 分钟）。（3）取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍预冷异丙醇，缓慢混 匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，-20C放半小时以上。（4）将析出的DNA离心，14000rpm, 10分钟。（5） 去掉上清，将沉淀用1ml 70%乙醇清洗一次，离心 干燥，溶于50 l ddH 0。2 2、酶切及电泳分析（1） 取四支1.5ml离心管，分别写上标记：g/EcoRI （学号）、g/HindIII（学 号）、入/EcoRI （学号）
9、和入/ Hind 111（学号）。（2） 前两支试管加入30 l基因组DNA。后两支试管加入3 l入基因组DNA。（3） 前两支加入5l lOXbuffer。后两支加入2 l lOXbuffer。（4）前两支分别加入ddHO 12.5 l,后两支分别加入ddHO 13 l22（5）分别加入RNase 1 l。（6）前两支试管分别加入1.5 l EcoR I和Hindlll, 10000rpm离心20 S混 匀。前两支试管分别（7）加入1 l EcoR I和Hind III, 10000rpm离心20 S 混匀。37C反应4h（8）0.8%琼脂糖凝胶电泳（样品全部点样）。（9）观察记录并分析实验结果 注：物制品是保存在-20或者-80最好，保存在-20-40是不行的，这是一个临界温度，会使DNA降解。
