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1、第一章综述1.1 柠檬酸简介1柠檬酸（citric acid）是生物体主要代谢产物之一,在自然界中分布很广,主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多.柠檬酸又名枸橼酸，学名2羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid）、2羟基丙烷1，2,3三羧酸（2hydroxypropane1，2，3-tricarboxylic acid)。分子式:C6H8O7 （相对分子质量：192.13）物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快,稍有涩味.极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。化学性质：从结构上讲柠檬
2、酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质.加热至175C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种较强的有机酸,有3个H+可以电离； 加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。1.2柠檬酸的基本性质及用途4柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理性能、化学性能、衍生物的性能，是广泛应用于食品、医药、日化等行业2最重要的有机酸。（1）用于食品工业：柠檬酸在食品工业占生产量的75%以上，因为柠檬酸有温和爽快的酸味，所以普遍用于各种饮料、汽水、葡萄酒、糖果、点心、饼干、罐头果汁、乳制品等食品的制造,到目前还没有一种可以取代柠檬酸的酸味剂.在所有有机酸的市场中
3、，柠檬酸主要用作清凉饮料、果酱、水果和罐头等的酸性调味剂,也可用作食用油的抗氧化剂、pH调节剂等。(2)用于化工和纺织业：柠檬酸在化学技术上可作化学分析用试剂，用作实验试剂、色谱分析试剂及生化试剂；用作络合剂，掩蔽剂；用以配制缓冲溶液，如柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液还可用于烟气脱硫6。采用柠檬酸或柠檬酸盐类作助洗剂，可改善洗涤产品的性能5，可以迅速沉淀金属离子，防止污染物重新附着在织物上，保持洗涤必要的碱性;使污垢和灰分散和悬浮;提高表面活性剂的性能，是一种优良的鳌合剂；可用作测试建筑陶瓷瓷砖的耐酸性的试剂.(3）用于禽畜生产7：在仔猪饲料中添加柠檬酸，可以提早断奶，提高饲料利用率510%,增加母猪
4、产仔量。在生长育肥猪日粮中添加1%2柠檬酸,可提高日增重，降低料肉比，提高蛋白质消化率，改善肉质和胴体特性。柠檬酸稀土是一种新型高效饲料添加剂,适用于猪、鸡、鱼、虾、牛、羊、兔、蚕等各种动物，具有促进动物生长,改善产品品质,提高抗病能力及成活率，提高饲料转化率，缩短饲喂周期等特点。1.3柠檬酸的生产方法柠檬酸的生产方法主要是从天然植物中提取和生物发酵法两种, 目前以发酵法生产柠檬酸为主3.生物发酵法又分为表面发酵法、固体表面发酵法和液体深层发酵法8。固态发酵能耗小但劳动力大， 占地面积大， 不适合大规模的生产应用。深层通风发酵法采用不锈钢罐体, 机械搅拌通风， 微生物在液体中分布均匀， 发酵时
5、不生成孢子, 全部菌体细胞用于代谢柠檬酸, 发酵速度高， 实现了机械化或自动化操作， 利于大规模生产.1.4 黑曲霉积累柠檬酸的机理1。41柠檬酸合成途径91)以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌糖化后产生高浓度的葡萄糖。2）、黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸:葡萄糖以EMP(糖酵解途径或者）、HMP（磷酸戊糖循环)两种途径产生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧形成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应后生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA缩合产生柠檬酸。1。42黑曲霉柠檬酸发酵的代谢调控（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节1.铵离子能够解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用,对该酶表
6、现出激活作用；铵离子的浓度与柠檬酸生成速度、积累有密切关系,故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量；2。培养基中锰缺乏时，黑曲霉的合成代谢受损伤，菌体结构不完整，但铵和氨基酸水平升高（锰缺乏时,蛋白质、核酸合成受阻，导致铵离子升高)（二）TCA环的调节1.柠檬酸合成酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点。柠檬酸发酵菌的柠檬酸合成酶对乙酰COA的亲和力随草酰乙酸浓度的提高而增大；2.顺乌头酸水合酶：理论上此酶失活TCA环阻断积累柠檬酸，顺乌头酸水合酶需要Fe2+ ，故在发酵液中添加黄血盐络合Fe2+,顺乌头酸水合酶活性降低；顺乌头酸酶、
7、异柠檬酸酶在pH2.0时失活；黑曲霉乌头酸水合酶催化的反应存在着柠檬酸：异柠檬酸：顺式乌头酸 = 90:7：3的平衡关系；黑曲霉对NAD+专一性的异柠檬酸脱氢酶活力很低，却有三种依赖于辅酶NADP+的异柠檬酸脱氢酶，其中的两种与TCA循环有关,它们受到生理浓度柠檬酸的抑制3. -酮戊二酸脱氢酶：黑曲霉-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA环被阻断)。1.43黑曲霉积累柠檬酸的机理9（1）由于严格限制供给锰离子等金属离子,或筛选耐高浓度锰离子、锌离子、铁离于等金属离子的菌株，降低菌体中糖代谢转向合成蛋白质、脂肪酸、核酸的能力,使细胞中形成高水平的铵离子,从而解除柠檬酸和ATP 对PFK酶的反馈抑
8、制，使EMP 的代谢流增大.（2） 黑曲霉中存在一条呼吸活动性强的侧系呼吸链，对氧敏感,但不产生ATP ,这样使细胞内的ATP 浓度下降。因而减轻了ATP 对PFK、CS 的反馈抑制，促进了EMP 的畅通，增加柠檬酸的生物合成。（3) 丙酮酸羧化酶是组成性酶，不受代谢调节控制,可源源不断地提供草酰乙酸，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA 和CO2固定反应取得平衡，保证前体物乙酰CoA 和草酰乙酸的提供,柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱，增强了柠檬酸的合成能力。(4）- 酮戊二酸脱氢酶是受葡萄糖和铵离子的阻遏,使黑曲霉中的TCA 变成“马蹄形的代谢方式，减弱TCA ，降低细胞内ATP 浓度,另外使
9、- 酮戊二酸浓度升高。反过来,又反馈抑制异柠檬酸脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解。（5） 顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸= 9037 的平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸，即柠檬酸分解活力低。一旦柠檬酸浓度升高到某一水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力,从而进一步促进柠檬酸自身积累，使pH 降至2. 0 以下。此时,顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸积累并排出体外1。5柠檬酸的发酵影响因素柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风量及pH值等条件。一般认为，黑曲霉适合在2534时产酸11。温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消
10、耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。微生物生成柠檬酸要求低pH，培养基需要用HCl 调节到pH 值2。5 产酸效果最好.在发酵生产实践中利用糖蜜原料进行发酵的初始pH 值要求在6.8 左右12,这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低,从而抑制了柠檬酸的合成.采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60饱和度对产酸有利。柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的
11、菌球体,有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体,而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低,使产酸迅速下降. 高浓度Mn2+ 将刺激乙酰辅酶A，造成草酰乙酸浓度下降，不利于合成柠檬酸。铜离子能抑制柠檬酸裂解酶活力10，培养基中加Cu2+ ，有利于达到最高柠檬酸产量。柠檬酸在顺乌头酸酶的催化下转化为顺乌头酸，进而转化为异柠檬酸，Fe2+是乌头酸水合酶专一激活剂，但柠檬酸发酵开始时，需要少量铁存在以促进菌体生长和为柠檬酸合成作准备,随后要控制Fe2+ 的存在才能开始并大量积累柠檬酸。1。6柠檬酸生产现状及展望313柠檬酸也称为第一食用酸味剂， 它不仅在食品工业上广泛的用作酸味剂、增
12、溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，而且在医药饲料、化工、电子、铸造和陶瓷等工业领域都有十分广泛的应用。柠檬酸- 柠檬酸钠由于其蒸汽压低、无毒， 化学性质稳定, 对SO2 吸收率高， 是一种极具开发价值的脱硫剂.对柠檬酸厂可通过母液和清洗废液制得, 具有极高的研究价值。将柠檬酸替代昂贵的羟基乙酸甲酸清洗液应用于高压锅炉的清洗已经有成功经验， 清洗效果好.今后，我国应加大柠檬酸深加工产品的开发力度，品种要多元化，产品质量要名优化，尤其增大柠檬酸在洗涤剂工业中的使用份额，使柠檬酸真正代替对环境和水质有污染的三聚磷酸钠，是我国柠檬酸业和洗涤业上一个新台阶。另外，要建设集约化生产经营的行业管理,加大企业的联合、
13、兼并和重组，形成年产柠檬酸万吨以上的大型生产厂家。参考文献1 生物工程专业实训讲义,上海交通大学生命科学技术学院2 贾玮玮 ，张丽 ，王春玲.国内工业生产柠檬酸工艺简介。中国化工贸易2012年7期3 孙荣, 王燕* ， 杨平平.柠檬酸发酵现状及展望. 中国调味品 2011年第 1 期 食品添加剂 总第36 卷4 东玉武； 孙建梅； 王景明 柠檬酸深加工产品的制法及用途 河北化工 2003-06-20 期刊 5 周合云 兰鸽 柠檬酸钠在洗衣粉中的应用表面活性剂工业1998年1期6姜秀平 刘有智。 超重力旋转填料床中柠檬酸钠法烟气脱硫 化工环保2011年5期7张建勋； 丛玉艳 柠檬酸在家禽饲料中的
14、作用机理 中国饲料 19980223 期刊 8 郑建光， 李忠杰, 项曙光 柠檬酸生产工艺技术及进展 2006 年08 月 第29 卷第8 期9 黄旭初,金湘,毛培宏 柠檬酸发酵菌黑曲霉的菌种改良述评 生物技术 第15 卷第3 期:93 2005年6月10 刘志伟,张晨柠檬酸发酵与控制J嘉应大学学报，1998(6)：556011 孙剑秋，臧威,姜赛男，李金，吴国才 不同发酵条件对黑曲霉利用玉米粉生产柠檬酸的影响中国调味品 2008年6月 第6 期12 陈西伟 pH值对柠檬酸深层发酵的影响与调节控制探讨 现代农业科技2009 年第5 期13 张晓蓉 柠檬酸生产现状、市场及发展前景 川化 2001-1115 期刊文中如有不足，请您指教！ /
