化合物的抗菌活性测定方案

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1、化合物的抗菌活性测定1. 供试微生物革兰氏阳性细菌3种：枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis ATCC 11562)、金黄色葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus ATCC 6538)、溶血葡萄球菌( Staphylococcus haemolyticus ATCC 29970)。革兰氏阴性细菌5种：根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens ATCC 11158)、大肠杆 菌( Escherchia coliATCC 29425)、黄瓜角斑病菌( Pseudomonas lachrymans ATCC 11921)、 沙门氏寒菌( Salm

2、oneua typhimurium ATCC 14028)；番茄疮痂病菌( Xanthomonas vesicatoria ATCC 11633)。供试真菌2种：稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae strain P131)、白色念珠菌(Candida albicans ATCC 10321)。2. 生长培养基2.1 LB琼脂培养基(Luria-Bertani agar medium)用于单体化合物抗细菌活性测定，配方为： 氯化钠5g,蛋白胨10g，酵母浸膏5g,琼脂20g，加去离子水定容至1000 mL,其中LB液 体培养基不加琼脂。2.2马铃薯葡萄糖液体培养基(Potato de

3、xtrose broth, PDB)用于抗白色念珠菌活性测定。配 方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，加去离子水定容至1000 mL。2.3燕麦西红柿培养基(Oat-tomato agar medium, OTA )用于稻瘟菌培养和产抱。配方为： 燕麦30g，西红丝汁150mL，琼脂20g，加水定容至1000 mL。3多孔板-MTT显色法(主要用于供试细菌和白色念珠菌的活性测定)3.1 MTT 反应原理MTT，又名噻唑蓝，3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,采用MTT 比色分析法可间接反映细胞的

4、增殖和活力水平。基本原理是活细胞体内的线粒体脱氢 酶能够将淡黄色的MTT还原成蓝紫色的化合物Formazane，该化合物可溶于酸性异丙醇、 二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂中，通过多孔板分光光度计依颜色深浅可测定出各吸光值。 生成Formazane的量与反应的活细胞数量成正比，而死亡的细胞不能将MTT转化以至没有 颜色变化或颜色变化较小，因此吸光值的大小可以反映活细胞的数量和活性程度，间接反映 化合物对供试菌细胞活力的抑制作用(边兴艳等， 1998)。3.2 MTT溶液的配制准确称取MTT黄色粉末250mg，加入50 mL pH 7.2、0.2 mol/L的磷酸缓冲液，超声振 荡混匀后，放置在

5、4C冰箱待用。3.3 测试样品母液的配制分别称取4 mg化合物溶于1.0 mL DMSO或无水乙醇或丙酮(30%=300+700)中，配成 4mg/mL的母液，然后用30%DMSO或30%乙醇或30%丙酮将化合物稀释，浓度范围在31. 25 卩g/mL 到 4000 卩g/mL 不等(初始浓度:4000, 2000, 1500, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31. 25 ug/mL)，(终浓度：400, 200, 150, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 ug/mL)。用于细菌活性测定的阳性对照为硫酸链霉素，配方如下：称取2 mg硫酸链霉

6、素溶于1.0 mL 乙醇(30%=300+700)中,配成 2mg/mL 的母液,然后用 30乙醇稀释,浓度范围在 15.625卩g/mL 到 2000卩g/mL 不等。初始浓度：(2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 ug/mL)，(终浓度：200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625 ug/mL)。用于白色念珠菌活性测定的阳性对照为两性霉素，配方如下：称取10 mg两性霉素溶于 1.0mL DMSO (30%=300+700 卩L)中，配成 10 mg/mL 的母液，然后用 30% DMSO

7、稀释， 浓度范围在 15.625卩g/mL 到 2000卩g/mL 等。初始浓度：(2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 ug/mL),(终浓度：200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625 ug/mL)。3.4 菌液制备将供试细菌接种到LB琼脂培养基上，28C培养24 h进行活化。然后将细菌接种到25 mL LB液体培养基中，28C摇培，转速为150-180 rpm，培养912 h。当澄清的LB培养基 变混浊时，表明细菌增值明显，生长旺盛，然后将菌液转接到新的LB液体培养基中进行稀 释，菌液浓度

8、调至为106 cfu/mL (OD620=1.0)。白色念珠菌的菌液制备与细菌的制备大致相同，只是将LB培养基换成PDB培养基。3.5 单体化合物对供试菌 MIC 值测定往洁净无菌的96孔培养板中加入浓度为106 cfu / mL的供试菌液90 yL,然后加入不同 浓度梯度的测试样品母液10 yL,阳性对照为不同浓度的硫酸链霉素10 yL (当供试菌为白 色念珠菌时，阳性对照为两性霉素10 yL)。同时设空白对照和溶剂对照(30%乙醇或30% DMSO或30%丙酮)，每个处理4个重复。化合物在菌液中的浓度均为母液浓度的十分之一。 将96孔板于28 C下在TS-8转移脱色摇床上振荡(15 rpm

9、),黑暗条件下培养24 h,然后 向每孔中加入5mg/mL MTT溶液10 yL,共培养4 h后，在1500 g下离心20 min,去上清， 每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 yL,再振荡30 min充分溶解Formazane。通过肉眼观察，多孔板中无蓝色物质生成的药剂浓度即为MIC (minimum inhibitory concentration value) 值。3.6 单体化合物对供试菌的抑制中浓度测定采用多孔板-MTT-分光光度法测定化合物对供试菌的半抑制浓度(IC50)值。用移液枪 吸取步骤(3.5)中一系列浓度梯度的显色菌液100 yL,相应转移至另一干净的96孔板中， 利用

10、多孔板分光光度计在 510nm 下测定光吸收值，按下式计算供化合物对供试菌的抑制率 ( %)：抑制率=无药对照孔OD沁m-药液孔OD沁m x100%510nm无药对照孔 OD试验结果采用Microsoft Excel软件进行数据整理，在分析中，供试样品浓度取对数(X), 抑制率换算成生物统计机率值(Y),求得抑制活性回归方程(Y = aX + b)，从而可以求得 抑制中浓度ic50。3.7 单体化合物对供试菌的 MBC 值测定为进一步验证MIC值的准确性，在已确定MIC值的浓度梯度下，将化合物的浓度梯度 再调节成如下三个浓度梯度：10MIC+0.5mg/mL, 10MIC+lmg/mL, 10

11、MIC+1.5mg/mL。然 后参照步骤(3.5)在多孔板中培养供试菌，每个浓度梯度设5 个重复，其中两个重复加入 MTT溶液验证其是否显色，剩下的三个重复菌液转接到LB固体培养基上，并用灭菌棉签 涂抹均匀(白色念珠菌转接到PDA培养基上)，培养24h后观察是否有菌落生成，没有菌落 生成的浓度梯度即为 MBC (minimum inhibitory concentration value)值。4 稻瘟菌孢子萌发抑制法4.1 培养基的配制制备燕麦西红柿培养基。4.2 稻瘟菌产孢4.2.1 稻瘟菌活化将长期保存在-20C下的稻瘟菌菌株，用灭菌的接种针挑取少量菌丝，接种到OTA培 养基平板上，用封口

12、膜封好，25C下黑暗培养7天。4.2.2 稻瘟菌继代培养将西红柿燕麦培养基倒入培养皿(=60 mm)中，每皿约20mL，制备成较厚的OTA 培养基平板。在已活化好的稻瘟菌菌落中央用移液枪滴加无菌水1mL，再用灭菌棉签轻轻 擦洗菌落表面。待无菌水变浑浊后，用移液枪吸取100 gL滴加到倒好的OTA培养基平板表 面，然后用玻璃涂棒将其涂摸均匀。待培养基表面干燥后，盖上皿盖，用封口膜封好，倒置 25 C 下培养 48h。4.2.3 机械刺激诱导产孢将继代培养后的稻瘟菌菌落表面滴加无菌水约3mL，用灭菌棉签轻轻擦洗菌丝，将菌丝 机械擦断，待灰色菌落变为黑色后，将表面无菌水吸去，晾干水分，用灭菌的纱布将

13、皿口封 住，置于干燥有光的条件下培养24 h,再转移室外培养2448h至即可得到稻瘟菌抱子。4.3 配制孢子悬浮液在已产抱的稻瘟菌平板上滴加无菌水3mL，用灭菌棉签擦洗菌落表面，洗下抱子并用 纱布过滤，将抱子洗液装到1.5 mL的离心管中，离心3次(离心力8000 g,每次离心15 min)。 然后将抱子液稀释，在血球记数板上滴加抱子液，调节抱子悬浮液浓度至2x106个/mL。4.4 配制抗菌活性物质溶液称取分离得到的单体化合物各 4 mg 到 Eppendorf 管中，根据样品溶解性分别用乙醇或 DMSO溶解，配成4000卩g/mL母液，然后稀释成含10%乙醇或10%丙酮的不同浓度梯度的 母

14、液，浓度范围在2504000 卩g/mL。初始浓度：800，400，300，200，100，50，25，12.5, 6.25, 3.125卩g/mL。终浓度：400, 200, 150, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625卩g/mL。稻瘟菌抱子萌发实验阳性对照为多菌灵，称取多菌灵1.0 mg到Eppendorf管中，向其 中加入无水乙醇溶液1.0 mL,振荡溶解，得到1000卩g/mL的多菌灵母液。然后用10%乙醇 溶液将多菌灵母液稀释为初始浓度：200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625卩g/mL 用作活性

15、测定。终浓度：100，50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78125 卩g/mL。4.5 活性测定准备洁净培养皿,在每个培养皿中放两层吸水纸和凹玻片,进行灭菌。灭菌后,往每皿 中加无菌水3 mL进行保湿。然后在每个凹孔加入25卩L配制好的稻瘟菌抱子悬浮液（2x106 个/mL）和系列浓度梯度的化合物溶液25卩L,用移液枪吸吐几遍，混合均匀。同时设空白 对照和溶剂对照（5% 乙醇或丙酮）,每个处理3个重复。将凹玻片放在保湿的培养皿中, 室温下光照培养8 h后观察抱子萌发情况。在显微镜10x10 （目镜x物镜）倍下观测每一凹 玻片上的孢子萌发情况,选择3个不同的视野,每个视野中约100个孢子,用计数器记下萌 发和未萌发的孢子数,然后计算孢子萌发率（%）。孢子萌发抑制率=4.6 数据处理和半抑制浓度的计算溶剂对照萌发率-处理萌发率溶剂对照萌发率x100%试验结果采用Microsoft Excel软件进行数据整理，在分析中，供试样品浓度取对数（X）,抑制率换算成生物统计机率值（Y）,求得抑制活性回归方程（Y = aX + b）,从而可以求得 半抑制浓度IC50。实验设空白对照和溶剂对照（5%乙醇，v/v）,每个处理3个重复。