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1、胶质瘤分子标记物I MGMT烷化剂是自然界中普遍存在的重要诱变剂和致癌物质，主要通过 形成O6-甲基鸟嘌呤(O6-mG )造成对细胞DNA碱基的烷基化损伤 发挥致癌、细胞毒和骨髓抑制等作用。2000 年 Esteller 等发现 O(6)- 甲 基 鸟 嘌 呤 -DNA 甲 基 转 移 酶 (O6-methylguanine Methyltransferase，MGMT)基因与烷化剂化疗的敏感性相关，随后 研究证实MGMT是一种可以编码修复O6-甲基鸟嘌呤的酶，定位于 10q26，它能够保护肿瘤细胞染色体免受烷化剂的细胞毒作用。和多 数管家基因相似，MGMT基因的启动子也少TATA盒和CAAT
2、盒，且 在其转录起始区域富含GC序列。MGMT启动子中CpG岛的过度甲基 化会降低基因的表达，从而导致基因沉默和抑制蛋白合成，阻碍 DNA 的修复。研究者们发现具有MGMT启动子甲基化的胶质瘤患者对化疗、 放疗更敏感，且肿瘤患者生存期较长。MGMT 是 DNA 修复蛋白，可逆转由烷化剂引起的 DNA 损伤。 其修复DNA的机制是通过自身活性中心的半胱氨酸残基(cys145)与 O6-烷基-鸟嘌呤(O6-AG)上的烷基团共价结合并将后者移除。DNA 甲基转移酶介导 MGMT 启动子 CpG 岛甲基化，可降低肿瘤细胞中 MGMT的活性。当MGMT启动子甲基化时，MGMT失活，DNA修 复受阻。这一
3、改变有助于替莫唑胺类烷化剂发挥治疗效果。一些胶质 瘤中存在MGMT启动子高甲基化。因此，MGMT启动子甲基化状态 已成为胶质瘤患者是否适合烷化剂化疗的重要分子指标之一。MGMT启动子包括含97个CG二核苷酸(CpG位点)的CpG岛。 在正常组织中， MGMT 的 CpG 位点一般都处在非甲基化状态。 MGMT 的 CpG 位点甲基化会导致染色体结构改变，从而阻止转录因 子结合、导致MGMT基因的沉默。MGMT主要分布于细胞质,DNA 损伤后才转移到细胞核。在细胞核中，MGMT可以使烷化剂作用下形 成的O6-甲基鸟嘌呤去甲基化，有效地修复DNA损伤，同时自身不可 逆失活为烷基化MGMT。MGMT
4、 个分子只能修复一个烷基加合物， 因此，MGMT被称为自杀酶。细胞的修复能力取决于MGMT在细胞 内的含量和合成速率，而mgmt基因启动子甲基化可以导致基因沉默 和抑制蛋白合成，阻碍DNA的修复。MGMT启动子甲基化在少突胶 质细胞瘤中发生率为 60%80%，在少突-星形细胞瘤发生率为 60%70%，在GBM发生率为20%45%，在间变性星形细胞瘤发 生率为40%50%，在毛细胞型星形细胞瘤发生率为20%30%。在 继发性GBM和低级别弥漫性胶质瘤中，MGMT启动子甲基化状态与 IDH 基因突变和 1p/19q 缺失的状态呈正相关。复发胶质瘤样本中MGMT 启动子甲基化水平较第一次手术样本多有
5、明显的增加，但胶质 瘤患者的中位生存期只受初治胶质瘤中MGMT启动子甲基化状态的影 响。MGMT启动子甲基化与胶质瘤对于烷化剂化疗的敏感性之间有密 切关系。 Hegi 等报道，接受放疗和替莫唑胺治疗的患者， MGMT 启 动子甲基化者具有更长的生存期。MGMT状态可提供预后信息，并对 治疗选择有指导意义。通过甲基化特异性聚合酶链反应（MSP ）检测 MGMT 启动子甲基化，不仅应用于实验研究，而且被列为临床常规诊 断项目。MGMT 基因启动子甲基化检测至关重要，然而 MGMT 基因未发 生甲基化时，其编码的MGMT蛋白容易受糖皮质激素、电离辐射、有 毒试剂等诱导而表达异常，所以采用病理标本免疫
6、组化检测MGMT蛋 白的活性并非十分可靠，而检测MGMT基因的甲基化可能会更特异、 更敏感。目前的MGMT甲基化检测方法大多是基于亚硫酸氢盐修饰的 定性检测方法，例如甲基化特异性PCR （ MS-PCR ）、联合亚硫酸氢 钠的限制性内切酶分析法（COBRA ）、荧光定量法（Methylight ）、 甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-HRM ）、亚硫酸氢盐处理 后测序等。其中MS-PCR与MS-HRM最为常见，MS-PCR在亚硫酸 氢盐处理后，根据预先知道待测片段的DNA序列设计两对引物（甲基 化引物为M-f和M-r，未甲基化引物为U-f和U-R），并进行扩增。 如果甲基化引物能扩增出片
7、段，则说明该检测位点存在甲基化，而未 甲基化引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。这种方 法的优点是不需要特殊仪器，经济、便利、灵敏度较高，可用于石蜡 包埋样本，且不受内切酶的限制。缺点是要先明确待测DNA序列，才 能设计出好的引物，且若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况则可能出 现假阳性结果。MS-HRM 是一种高灵敏度、高重复性的甲基化检测方法，是根据 已知甲基化程度的标准曲线对样品的甲基化百分比进行测定的方法。 由于甲基化DNA含有更多的GC,且相对更难熔解。亚硫酸氢盐处理 后，甲基化与未甲基化DNA 会存在序列差异，此时通过熔解曲线分析 样品的熔解温度及峰型，可轻易区分完全甲基化
8、、完全未甲基化或杂 合甲基化。MS-HRM进行甲基化分析仅需一对引物，相比以往的方法 更加快捷、简便和精确。不过对仪器有一定的要求，必须拥有带HRM 模块的荧光定量PCR仪。MGMT 甲基化可采用基因芯片分析。首先将基因组 DNA 分成两 份，一份用来做MeDIP，另一份作为对照。两个样品都标记荧光(富 集的样品用Cy5标记，对照用Cy3标记)，然后与芯片杂交。芯片上 每个探针的 Cy5/Cy3 强度比例显示出该区域的甲基化程度。随着第三 代测序技术的出现， Chin 等在 Nature Methods 阐明单分子实时(SMRT )测序技术甚至能够直接测定DNA的甲基化。该方法通过对 DNA
9、聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链的过程(荧光 脉冲的到达时间和持续时间)进行实时监测，直接检测DNA模板链中 的修饰核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧 啶。Ref： 于士柱, 孙翠云. 胶质瘤分子病理学进展及其在精准治疗中的应用 J. 中华神经外科疾病研究杂志, 2016, 15(5):385-388.陈铌,周桥.胶质瘤诊断与预后的一些常用分子标记J.临床与实 验病理学杂志, 2016, 32(8):841-845. 宣自学, 袁守军, 王维,等. MGMT 基因甲基化检测在神经胶质瘤 治疗中的应用J.肿瘤学杂志,2016, 22(10):850-855. 刘玉清, 刘幸, 江涛. 分子分型与分子病理指导下的脑胶质瘤诊疗 进展J.科技导报,2017,35(4):64-67.BCX编辑丨罗卫
