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1、实践三 病毒血凝和血凝克制实验-（以新城疫为例)实践目的：1掌握血凝(HA)和血凝克制(HI)实验的原理2.掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝克制实验的操作措施实践原理: 某些病毒(如鸡新城疫病毒,禽流感病毒等)可以与人或动物的红细胞发生凝集,此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体(免疫血清）所克制,即为红细胞凝集克制实验。实践内容:.红细胞凝集实验(HA实验） 重要是测定病毒的红细胞凝集价，以拟定红细胞凝集克制实验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行阐明。鸡新城疫病毒的HA实验现采用微量法,在形微量反映板上进行。 （1)一方面用微量移
2、液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴(25)。()用微量移液器取病毒抗原液2加入第孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25l液体小心地移至第2孔,如此持续稀释至第1孔,第1孔吸取25l液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:21:208,第孔为红细胞对照。 (3)再以微量移液器每孔加1.0红细胞悬浮液1滴()。 ()在振荡器上振荡混匀约2分钟,再置37作用15分钟后观测成果。(5）每次测定样品都应同步做红细胞对照。表1 鸡新城疫血凝效价(H)的测定术式（微量法）孔号12367891012病毒稀释倍数1:2:4：81:11：31:641:1281：6:51:1021:2048
3、对照生理盐水25l25l5l25l25l25l252525l25l25l病毒液5l25l25l5l2l525l5l25l2l25l25l弃去1%红细胞悬液25l25l2525l255l5l25l25ll25l25l感作 置振荡器上混匀12分钟,放7静置1分钟成果例示#+- 表达100完全凝集 + 表达50%凝集 表达不凝集成果鉴定：将反映板倾斜成5度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀，表白红细胞未被或不完全被病毒凝集;如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动,阐明红细胞被病毒所凝集。 能使100红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数,称为该病毒液的红细胞凝集效价。如
4、上例：病毒液的HA效价为:18,H实验时,病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成122倍的稀释液。2红细胞凝集克制实验(H实验) 有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行阐明。 （1)用微量移液器每孔各加入滴稀释液（即25),从第1孔到第10孔。第1l孔加稀释液2滴(50l)。 (2)以微量移液器取被检血清5l,放入第1孔,，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使被检血清与稀释液混合均匀,再吸取25液体小心地移至第2孔,如此持续稀释至第0孔,最后第十孔吸取25液体弃掉;被检血清稀释倍数依为1:2：104,第11孔为红细胞对照,第十二孔为抗原对照。 (3）每孔再加入具有四个单位的病毒液
5、1滴(25l)至第孔,第1l孔为红细胞对照孔，不加病毒液；第十二孔为抗原对照，加病毒液。 (4）置振荡器上振荡l2分钟后,放7静置20分钟。 (5)每孔再加入0%红细胞悬浮液1滴(5l)放振荡器上振荡l2分钟混匀,置3,分钟后鉴定成果。表2 鸡新城疫红细胞凝集克制(H1)实验(微量法)孔号3457101被检血清稀释倍数1:21:41:81:161:1:641:121：256：521：1红细胞对照抗原对照生理盐水25l25l25l5l5l25l52ll25l0l2l被检血清25l25l25l5l5252l2l55弃掉4单位病毒液255l25l2l25l525l2振荡器上振荡2分钟，放37作用0分
6、钟%红细胞悬液5l2l2l2l5l25l5l55l2ll2l振荡器上振荡1分钟,放137作用15分钟成果例示-#注: 表达不凝集 、+ 表达部分凝集、 # 表达完全凝集 。成果鉴定:将反映板倾斜成4度角,沉于管底的细细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀,表白红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底,凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动,阐明红细胞被病毒所凝集。能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全克制的血清最高稀释倍数,称为该血清的红细胞凝集克制效价,用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数(10)表达。如上例，该血清的红细胞凝集克制效价为1：128或HI效价为7(10g2)。成果分析:
7、(1)一般觉得鸡的免疫临界水平为1:8(成年）或1:16(雏鸡)，随处区不同而稍有差别。 (2)鸡血清H抗体效价高于1:16时可合适推迟新城疫免疫的时间,HI抗体效价在1:16如下，须进行新城疫疫苗接疫种，在新城疫流行的地区或鸡场,鸡的免疫临界水平应稍提高。 （3)鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的HI抗体效价（2）的平均值表达的。 如果某鸡群的1份样品中，HI抗体效价(2)为8的有3份样品,为7的有5份样品,为的有2份样品,它们的平均值为: 8375+62/327.1平均水平在4（10g2)以上，阐明该鸡群为免疫鸡群。若在检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，则不能用上法计算平均水平,
8、应根据临界水平如下的样品数在所有样品中所占的比例决定免疫与否。 ()大型养鸡场，每次进行抽测时,抽样率一般不低于.1%一0.5%,小型鸡群,抽样率应有所增长，一般觉得抱负的抽样率应为2.0。 （5)鸡群接种新城疫疫苗后,经2周测血清中的HI抗体效价,若提高2个滴度以上，表达鸡的免疫应答良好,疫苗接种成功；若HI抗体效价无明显提高,表达免疫失败。作业：1每三位学生做一种血凝实验,测定出新城疫病毒的血凝效价,记录实验成果。2.根据血凝价将新城疫病毒稀释成4个单位病毒液，每三位学生做一种血凝克制实验,检测待检血清的血凝克制效价,记录实验成果3.回答问题:（)病毒的血凝和血凝克制实验的原理是什么?(2
9、）病毒血凝反映是抗原抗体反映吗，为什么?（)病毒血凝克制反映是抗原抗体反映吗，为什么?实践三 病毒血凝和血凝克制实验-（以新城疫为例)(一)实践目的：1、 掌握血凝及血凝克制实验的基本措施及原理2、 掌握鸡新城疫的实验室诊断技术。(二）实践内容与基本规定： 实践原理:某些病毒,如鸡新城疫、禽减蛋综合症等,有能凝集动物红细胞的特性,此即红细胞凝集现象。这些病毒囊膜上有糖蛋白血凝素，能与动物的红细胞表面的糖蛋白受体结合,发生红细胞凝集现象。可以运用这一特性判断被检材料中有无病毒的存在,并可以测定病毒的效价。1、 血凝实验:常多用感染鸡胚液进行，凝集价可达1:160-：60也可采用急性病例的组织浸出
10、液，但凝集价较低。本病毒可凝集许多动物的红细胞，但凝集性能不够稳定，故一般作血凝实验时都采用鸡的红细胞采血部位为心脏或翅静脉，取血后加抗凝剂或脱纤维,置于离心机中摇转加生理盐水洗涤三次后,将浓缩的红细胞配成生理盐水悬液,即可应用。 操作措施见实习指引。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数,称为该病毒的血凝滴度。2、 血凝克制实验:单纯地使用血凝实验还不能作出明确的诊断,由于尚有其他病原也能引起红细胞凝集，如引起慢性呼吸道病的禽败血支原体。因此需用已知的抗血清作血凝克制实验，以鉴别病毒。也可用已知病毒来测定病鸡血清中的抗体,而得明确的诊断。但不适于急性病例，一般要在感染后的5-0天，或浮现呼
11、吸症状后的天,血清中的抗体到一定水平，就可用试管法。(三)重要器材与药物器材:离心机、试管架、试管、注射器、针头5-55号、感染鸡胚,微量移液器套，V型、9孔板,滴头，微量振荡器,塑料采血管，药物:病毒:鸡新城疫弱毒疫苗；0.%生理盐水、1%红细胞浑悬液、血清、4单位病毒。 原则阳性血清；浓缩抗原；05%红细胞浑悬液；被检血清;H7.07.2磷酸缓冲盐稀释液;pH7.07.2磷酸缓冲盐稀释液：氯化钠(126677)7g；磷酸二氢钾（GB277）1.；氢氧化钠（GB69）3.g；蒸馏水100l；高压灭菌，4保存，使用是作2倍稀释。鸡红细胞悬浮液:由健康来航公鸡羽根静脉采血迅速置于装有抗凝血剂(3
12、柠檬酸钠溶液)的离心管中,用生理盐水洗涤3次，每次以3000rmin离心0分钟，将血浆、白细胞等充足洗去,根据沉淀的红细胞压积,用H=7的生理盐水稀释成1%悬浮液。 被检血清:每群鸡随机采30份血样，分离血清。 采血法:先用三棱针刺破翅下静脉,随后用塑料管引流血液至68cm长。将管一端烧融封口,待凝固析出血清后以1000rmin离心5分钟，剪断塑料管,将血清倒入一块塑料板小孔中,若需较长时间保存,可在离心后将凝血块一端剪去,滴融化石蜡封口,于0oC保存。(四）实践措施操作措施4.1 微量血凝实验4.1 于微量血凝板的每孔中滴加磷酸缓冲盐稀释液50ul，共滴四排。4.2 吸取1:5稀释抗原滴加于
13、第一列孔，每孔5u，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11孔各吸取50l弃之。最后一列不加抗原作对照。. 于每孔加入0.5红细胞悬液50u。.4 置微型振荡器上振荡1分钟,或手持血凝板绕圆圈混匀。4.1.放室温下(1820o)3040分钟,根据血凝图象鉴定成果。以浮现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。每次四排反复，以几何平均值表达到果。4.1.计算出含4个血凝单位的抗原浓度,按式（B1)进行计算。抗原应稀释倍数=血凝滴度4.（B1)上述材料所有按顺序加完后,振荡孔板，使红细胞与病毒充足接触，然后置于2-22室温中静置，自第15分钟开始观测成果，每5分钟检查一次,至60分钟结束,观测成果时注意不要摇震孔板。 如果被检材料中有病毒的存在，就会浮现红细胞的凝集现象，红细胞浮现凝集反映者,凝集成片或碎片，呈伞状铺于管底
