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1、TTV核酸模板快速制备方法07-08-23 11:47:00 编辑：studa20作者：苏明权，冯继红，于文彬，徐光华，马越 云，张建芳，张林，刘家云【关键词】TT 病毒关键词:TT病毒;聚合酶链反应；核酸制备摘要：目的寻求建立适合大批量临床标本检测 TT病毒（TTV核酸快速制备方法，直接用于PCFT增.方法应用蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法与直接快速裂解法，分别制备TTV核酸做PCR莫板，用于TTV的聚合酶链反应的快速 检测结果 在30例非甲非庚型肝炎血清和50例慢性乙型肝炎患者血清， 应用经典的蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法和直接快速裂解法，分别制备TTV核酸模板，在相同条件下进行PCRT增，结果两种
2、制备方法的符合率为89%.结论 TTV是一种新发现的肝炎病毒，目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为 诊断依据，建立了具有快速、简便、适合大批量临床标本中TTV核酸制备方法，对TTV肝炎的快速诊断，具有重要的意义.Rapid preparatio n of tran sfusi on tran smitted virus nu cleicacid templateSU Min g-Qua n1 ，FENG Ji-Hong2 ，YU Wen-Bin1 ，XU Guang-Hua2 ，MA Yue-Yun1 ，ZHANG Jian-Fang1 ，ZHANG Lin1 ，LIU Jia-Yun11 C
3、enter of Clinical Molecular Biology，Xijing Hospi-tal ，Fourth Military Medical University，Xian710033，China，2 Deparmentof Infectious Diseases ，College of Medicine ，Yanan University，Ya nan716000Keywords:tra nsfusi on tran smitted virus;polymerase cha in reactio n;DNA preparati onAbstract:AIM To establi
4、sh a method adapti ng to rapid preparati on of TTV DNA from bulk samples for PCR.METHODS TTV nu cleic acid template was prepared for PCR using two methods ，viz.hydroxybenzene chloro-form extract ion and directly rapid cracki ng.RESULTS DNA abstracted by the two methods was amplified at same PCR para
5、meter and the coi ncide nee rate was89%.CONCLUSION TTV is a new discoveredhepatitis virus and the main laboratory diagnosis method is to detect its DNA by PCR ，so it is very important to establish a method for rapid preparation of TTV DNA from bulk samples.0 引言TT病毒是近年新发现的一种肝炎病毒，当发现一种新的病原性相关病毒因 子时，建立
6、一种敏感、快速、特异的实验室检测方法并评价该病毒因子在肝病 中的价值是十分重要的，该方法的临床适用性和可行性，是评价所建立方法在 临床上应用价值的关键所在 . 目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依 据，建立具有快速、简便、适合大批量临床标本中 TTV核酸制备方法，对TTV 肝炎的快速诊断，具有重要的意义 . 我们从临床快速检测需要为目的，寻求建立 一种快速、简便的TTV核酸制备方法，用于大批量临床标本的检测，获得满意 的结果.1 材料和方法1.1 材料非甲非庚型肝炎血清30例，来自延安大学医学院传染科；慢性乙型肝炎 患者血清 50例，来自西京医院就诊患者 ;引物及合成:根据 Nishiz
7、awa 等1 报道的引物，外引物：RD037 (正义链)5-GCAGCAGCATATGGATATGT-3RD反8 义链)5-TGACTGTGCTAAAGCCTCT，扩增片段：270bp;内引物:RD051 (正义 链)5-ATACA-CATGAATGCCAGGC-3RD0反义链)5-GTACTTCTTGCTGGTGAAAT- 3扩增片段:196bp，由上海博亚生物技术有限公司合成.1.2 方法蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法:50卩L血清加200卩L裂解液(50mmo? L-1 Tris-HCl pH8.0， 200mmo?l L -1 NaCl ， 10mmo?l L-1 EDTA， 20g? L-
8、1SDS 1g? L-1蛋白酶K), 60C水浴60min,加等体积酚：氯仿：异戊醇(25 : 24： 1)混匀，4C冰浴下30min, 2000g离心10min,取上清加等体积预 冷无水乙醇-20C过夜，1000g离心20min,沉淀溶于20卩L0.1 xTE缓冲液中， 备用直接快速制备法:20卩L血清加50卩L快速裂解液(50mmo? L-1 Tris HCl， pH8.0， 50mmo?l L1 KCl， 1.5mmol? L-1 MgCl， 10g? L -1 NP-40 ， 5g? L-1 Tween-205g ? L-1 Triton X-100, 2.0g? L-1 SDS)煮沸
9、 20min, 1000g 离心10min,取上清做模板.PCR扩增:第1轮PCR扩增：总反应体积为25卩L, 包括:10 x PCR缓冲液 2.5 卩 L;4 x dNTP2.0 卩 L;外引物各 1.0 卩 L (50pmol? L -1 ) ;DNA模板5.0卩L;Taq DNA酶3U?卩L-1 ;无菌蒸馏水12.5卩L;无菌石蜡 油30卩L覆盖液面，94C变性3min,进入PCR循环，循环条件:94 C 50s, 55r 50s, 72C 70s, 32个循环，最后72C延伸5min.第2轮PCF扩增：总反应 体积为25卩L,包括:10 x PCR缓冲液2.5卩L;4 x dNTP2.0卩L;内引物各1.0卩L(50pmol? L-1 );第 1 次 PCF产物 5.0 卩 L;Taq DNA酶 1.5U?卩 L -1 ;无菌蒸 馏水12.5卩L;无菌石蜡油30卩L覆盖液面，94C变性3min,进入PCR循环，循 环条件:94 C 50s, 55C 50s, 72C 70s, 32个循环，最后72C延伸5min.产物 检测：取15卩L第2次PCRT增产物，于20g? L-1琼脂糖（含EB）凝胶中，电 泳100V30min,紫外灯下观察结果，出现196bp片段者为TTV阳性.
