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1、引物合成的步骤及方法介绍Oligo DNA的人工化学合成始于50年代初期，1980年，全自动的固相DNA合成仪面市后，使得快速、高效 合成Olig。DNA成为可能，这大大地推动了生物工程技术的蓬勃发展。现在一般都采用B-乙腈亚磷酰胺化学合成Oligo DNA，将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的合成 时从3 5方向进行，通常3端的第一个碱基结合在Glass担体(Controlled Pore Glass， CPG)上。其具 有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。合成步骤St epl：脱掉附加在CPG担体上的第一个碱基5 -OH基团上的保护基(DMTr)，准备附加下一个新的碱基
2、;Step2：活化新的碱基单体(Phosphoramidite)，准备与第一个碱基进行反应；St ep3:第二个碱基与第一个碱基发生偶联反应；Step4：将没有反应的第一个碱基的5 -OH加帽封死(Capping)，使其不再进一步参与反应；St ep5 :将核苷亚磷酸酯氧化成更稳定的核苷磷酸酯(即将三价磷氧化成五价磷)。St ep6：重复进行St eplSt ep5的循环，直至合成完所需的Oligo DNA序列。Step7:合成结束后，将Oligo DNA分子从CPG 上切下，再进行进一步的纯化。CH(Ch)sN CHfCKih(DMA链环离延備)OCHzCHsCN(Ac)sO /DM AFT
3、- st0 N1chscc-卜图1 Oligo DNA合成原理。N1代表第一个碱基，N2代表第二个碱基，依此类推。 OD数的确定一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼 接或退火后做连接，1 OD就足够了。但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长，最 后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求，也是一种浪费。 引物纯度检测实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电 泳。取0.2-0.50D的引物，用尿
4、素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前 加热变性（95C,2mins）。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电 压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带 之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用EB染色或银染方式染色。引物级别选择应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增 45 basePAGE诊断PCR扩增 40 baseOPC， PAGEDNA测序20 base左右OPC亚克隆，点突变等根据实验要求OPC， PAGE， HPLC基因构建（全基因合成）根据实验要求PAGE反义核酸根据实验要求PAGE修饰引物根据实验要求PAGE， HPLC
