高效液相色谱柱

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1、高效液相色谱柱怎样选择色谱柱 现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但是色谱填料的选择 范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。1、正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）,以及其他具有极性官能团，如胺基团（NH2,APS） 和氰基团（CN, CPS）的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他团的极性较强， 因此，分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。 正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二 氯甲烷（Methylene Chlori

2、de）等。2、反相色谱 反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使 用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极 性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18（ODS）、C8 （MOS）、C4 （B）、C6H5（Phenyl）等。二、聚合物填料聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为114均可 使用。相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白 质等样品的分离非常有效。现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色

3、谱柱柱效较低。三、其他无机填料其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如 石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相，石墨 化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚 合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由于HPLC流动相中不会 被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC，氧化铝微粒刚性强，可 制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化 合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用，新

4、型氧化锆填料也可用于 HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH范围114，温度可达 100C。由于氧化锆填料几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行 中。怎样选择填料粒度目前，商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3um、5um 和 10um 填料，填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，填充柱的 柱效越高；小于 3um 的填料应用，在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯 一的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选择更小粒度的填料是很有用的， 3um填料填充柱的柱数比相同条件

5、下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色相谱的 背压却是 5um 的 2 倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选择更短的色谱柱，以 缩短分析时间，另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈 代替甲醇，以降低色谱柱的压力。一、如何保证良好的柱性能与柱寿命认证阅读色谱柱使用说明书；使用填充良好的色谱柱； 尽量减少压力波动，避免机械及热冲击； 使用保护柱及在线过滤器； 经常以强溶剂冲洗色谱柱； 充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分；用稳定的固定相（C18最稳定）; 在中等 PH 值操作（68），用有机缓冲溶液；色谱柱使用温度最好小于40C；

6、硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的 PH 值范围在 3.08.0；在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠；流动相中含有缓冲溶液，应注意应95： 5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5%； 过夜或贮存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流动相保存（乙晴最好）。HPLC 固定相及应用范围名称别名功能基团正相反相离子对应用Silica-OH非极性和中等极性以及非离子性有机化合物。SASCl-(CH3)3在所有的烷基键合相中对非极性化合物保留最弱，典型用于中等极性和多官能团化合物.ButylC4-C4H97分离肽和蛋白质，保留时间比C8和C18短。MOSC8,-C8H177中等极性相中对中等化合

7、物，小肽和蛋白质，Octyl极性药族化合物和环境样品。ODSC18-C18H377烷基键合相中对中等极性化合物保留最强。广泛用于药物，甾族化合物，脂肪酸和环境样品.CPSCN ,Cyano-(CH2)3CN7 7对极性化合物有独特的选择性，适合应用于正相（propyl分离，当用于反相系统时，其选择性与C8和Nitrile）C18不同，在药学领域和复杂混合物的分离中应用广泛。APS NH2-（CH2）3 NH2 V V反相中分析糖类和其他极性化合物。弱阴离子交（Amino Propyl）换，阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性剂 做流动相。正相中与硅胶的选择性机改性剂 不同，分析芳香族效果很好。

8、Phenyl-(CH3)C6H5VV芳香族化合物Diol-(CH2)2O V V反相时，分离肽和蛋白质。正相时，与硅选择CH2(CH2OH)2性相似,但极性较弱。SCX强阳离子父换-(CH2)2C6H4SO3H-V有机碱SAX强阴离子父换-(CH2)3N+(CH3)3有机酸，核苷和核苷酸二、如何解决色谱柱使用过程中出现的问题1. 保留值与分离度重现性不好原因分析问题原因表现不同色谱柱间差异填料、键合相不同保留因子（k）,分离因子（a）使用期间柱变化柱床破坏柱效（N）柱外效应键合相丢失硅胶基质溶解强保留分堆积堵塞保留因子（k）,分离子（a）柱效（N）保留因子（k）,柱效（N）系统差异，进样量大、

9、柱效（N）进样阀与 色谱柱之间、 色谱柱与检测器之间管 路太长、检测器流通池 体积大、接头死体积大等。分离效果变差流动相组分改变保留因子（k），柱效变化很小流速改变保留因子（k）,分离因子（a）温度改变保留因子（k），柱效变化很小柱平衡慢重新平衡时间不够保留因子（k）,柱效变化很小柱超载样品量太大保留因子（k）,柱效（N）2造成色谱峰（不对称）拖尾的原因1. 色谱柱本身填装问题，筛板堵塞或填料塌陷；2. 柱头有污染；3 样品超载；4 样品溶剂不合适；5.柱外效应；6 化学或二次保留（硅羟基）效应；7 缓冲容量不足或不合适；8 重金属污染。3. 如何解决峰形拖尾的问题A. 与化学有关的拖尾问题1

10、流动相中，加入 30mM 的三乙胺（用与碱性化合物）或醋酸胺（用与酸性化合物），未知 化合物加醋酸三乙胺；2如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；3.降低进样量至vlug。B. 与色谱柱有关的拖尾问题1如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二碌甲烷与4%甲醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗，正向柱可用甲醇冲洗。2. 使用保护柱C. 与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽1. 进样体积过大，（通常25uL）；2. 进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（最佳连接管应v20cm，内径为0.007）；3. 检测器流通池的体积过大。4. 如何储存色谱柱1. 防止缓冲

11、溶液和水溶液流动相产生微生物，做到流动相用多少配多少，或在水流动相中加 200ppm 的叠氮钠以抑制细菌成长（一定当心其毒性和潜在的爆炸性）；或在流动相中加 20% 的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气。2. 尽可能将色谱柱贮存于 100%有机溶剂（乙晴最好）中，避免在缓冲溶液中保存。3. 使用缓冲溶液后的色谱柱，应用1520倍柱体积的不含缓冲剂的同种水一有机溶剂流动相 冲洗色谱柱，后换成 100%有机溶剂储存。4避免用纯净水冲洗键合致密的 C18 柱。 5将色谱柱的两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。 如何选择保护柱怎样选择保护柱，但又不能影响分离分析？这是色谱工作者

12、经常提出的一个问题。通常， 在选择保护柱之前首先要考虑的是样品是否清洁。对于大部分分析工作者来说，一只 1cm 长 的保护柱，那么就应选择2cm或3cm长的保护柱。保护柱越长，自然所装填的色谱填料就越 多，则其越能避免污染物进入分析色谱柱的机会。当然，随着保护柱的长度加长，样品的保留 时间会比使用短保护柱长。一般来说，保护柱的内径与分析色谱柱的内径相同或相当即可。保 护柱的填料装填方式也很重要。目前有薄膜装填法的保护柱，使用过程很简单方便，而且可以 在实验室中进行干装。但是，其最大的缺点是不经济，特别是针对中国的具体情况，一次性使 用相对费用较高。另外，薄膜装填法的保护柱所装填的色谱填料有限，

13、只能提供有限的保护作 用；不过也因为所装填的色谱料较少，保护柱的长度也较短，所以对分析样品的保留时间的影 响也很小。另一种保护柱结构其实质是缩短了的色谱分析拄，设计方式上有直连式、手紧式或 整体式。整体式设计是由色谱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的，必须与色谱分析柱一同 订货，可以非常方便地使用，但不能够被修改。直连式结构设计可在任何时候有色谱工作者来 安装连接，可以与任何品牌的色谱分析柱连接使用，而且还可以根据样品的相关情况选择不同 的保护柱长度。手上紧即可。另外从保护柱结构又分为是否可以更换保护柱柱芯。可以降低保 护柱的使用成本。大多数人是根据色谱分析柱的填料选择保护柱的填料，正常情况下可以选择 与分析色谱柱一样的色谱填料。但是，根据实际的分析工作，也可不必与分析色谱柱的填料完 全相匹配。 对于选择保护柱的原则是：在满足分析分离要求的前提条件下，尽可能的选择较短的保护柱结 构，尽可能选择对分离样品小一些保留性的填料。