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1、实验二 苹果中多酚氧化酶最适 pH 的测定一、实验原理存在于果蔬中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO在适宜的条件下能引 起果蔬的酶促褐变。 因此，多酚氧化酶对于食品加工具有重要意义。 多酚氧化酶 是一种含铜离子的酶，它能催化两类不同的反应。一是一元酚羟基化，二是邻 - 二酚氧化。在一些植物中， 多酚氧化酶能同时催化这两类反应； 而在另一些植物 中，多酚氧化酶仅能催化邻 -二酚氧化，却不能催化一元酚羟基化。如果采用邻 - 二酚作底物，那么随着酶催化反应进行，反应混合物的吸光值因邻-苯醌的量的增加而增大，因此可采用分光光度法测定多酚氧化酶的活力。二、试剂和仪器试剂：0.2m
2、ol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，pH分别为3.6、4.0、4.6、5.0和5.6、0.2mol/L 磷酸盐缓冲液，pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0、0.01mol/L儿茶酚溶液、0.05mol/L 磷酸盐缓冲液，pH=6.5、丙酮仪器：组织捣碎机、抽滤装置、 721 分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃 仪器、离心机三、实验步骤1 、从苹果中萃取多酚氧化酶将100 g苹果迅速去梗和核后切成小块，和 400mL左右预先冷冻至26E 的丙酮一起倒入组织捣碎机中均质（20,000 rpm，2 min），然后迅速抽滤，保留 滤纸上的沉淀部分， 将沉淀薄层中残留的丙酮用冷风吹去， 至沉淀无
3、丙酮味。 将 所得丙酮粉转移至 150 mL 0.05mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH 6.5）中，搅拌 30 min， 然后离心（4C ,10000 r/m,20 min），离心所得上清液如有混浊，则用 8层纱布过 滤，从而得到多酚氧化酶提取液。2、不同 pH 下多酚氧化酶活力的测定在比色皿中分别加入 1.81.1 mL pH 为 3.6的缓冲液和 0.7mL 儿茶酚溶液， 搅匀后加入 0.51.2mL 多酚氧化酶提取液， 迅速搅匀，测定反应混合物在 400 nm 下的吸光值随时间的变化， 参比以缓冲液代替酶液。 依次测定 4.0、 4.6、 5.0、 5.6、 6.0、 6.5、 7.0、
4、 7.5、 8.0几个 pH。四、数据记录与处理数据记录：pH值3.64.04.65.05.66.06.57.07.58.0加酶量1.01.2（mL）100D 值0.1720.1660.1600.1500.1470.1150.1060.1300.1600.151(12s)(12s)(12s)(15s)(11s)(11s)20 0D 值0.2140.2040.2100.1940.1490.1150.1070.1320.1620.15130 0D 值0.2580.2500.2580.2400.1520.1150.1090.1340.1630.151400D 值0.3000.2950.3020.29
5、60.1560.1170.1080.1350.1650.152500D 值0.3410.3380.3480.3290.1610.1170.1100.1360.1660.15360 0D 值0.3820.3770.3920.3730.1660.1180.1110.1370.1700.154700D 值0.4200.4180.4330.4150.1710.1210.1130.1390.1730.15680 0D 值0.4570.4560.4750.4550.1750.1230.1170.1430.1750.15890 0D 值0.4940.4940.5140.4960.1790.1260.1180
6、.1430.1780.1611000D 值0.5290.5300.5540.5340.1860.1270.1200.1450.1820.1641100D 值0.5650.5670.5910.5720.1880.1300.1210.1510.1840.165120OD 值0.5980.6010.6260.6070.1920.1330.1240.1510.1880.168用Excel处理数据，得到不同pH下消光-时间曲线的斜率，斜率的物理意义即每 分钟增加的消光值，也即酶的活力单位数。oH 3.6N5时间(min)1CL 120,pH50, IS0. IS0.170.1500.170.16数据处理
7、Q. 140.150.U. 50,13o. ie0. 16U. 5u. 5r 8. 0pH 7.00.0096bd0.1 KZ = 0.260:a. Dll 4140.1273 R*2 = 0. %1O时问（min时间（min时间（minJpH值3.64.04.65.05.66.06.57.07.58.0加酶量1.0mL1.2mL酶活力0.23280.24100.25400.24980.02640.01020.01020.01140.01550.0098酶活mL0.23280.24100.25400.24980.0220.00850.00850.00950.01290.0082用ExceI作图
8、得到下图:pH由酶活力-pH曲线关系可以得知苹果中的多酚氧化酶在 pH=4.6时的酶活力 最高，也就是说pH4.6是苹果中多酚氧化酶的最适 pH。五、讨论1、苹果中存在着多酚氧化酶的天然底物，因此在制备多酚氧化酶提取液的过程 中，快速和低温是必要的条件，否则将得到褐色的酶液。2、丙酮可使酶蛋白沉淀下来，从而与天然底物分离，但是常温下丙酮会导致酶 变性，因此必须先冷却至-26。事实上，在试验中，丙酮并没有冷却到-26C， 因此匀浆时现取现用。3、本实验所测酶活较低，可能有两个原因，一是所选的两个苹果有一个是红苹 果不是酶活相对高点的青苹果；二是在通风橱里用吹风机吹去丙酮时， 所吹的风 不是冷风，二是带有温度的热风，导致酶有些许的失活所致。
