氨基酸的测定方法

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1、食物中氨基酸的测定方法测定食物中的胱氨酸使用过甲酸氧化-氨基酸自动分析仪法，测定色氨酸使用荧光分 光光度法，测定其它氨基酸使用氨基酸自动分析仪法。一、氨基酸自动分析仪法1. 原理食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三 酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。一份水解液可同时测定 天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16 种氨基酸，其最低检出限为10pmol。2. 适用范围GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法。本法适用于食物中的16种氨基酸的测定。其最低检出限为10pmo 1。本方法不适用于

2、蛋 白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定3. 仪器和设备3.1真空泵3.2恒温干燥箱3.3水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积2030ml。用去离子水冲洗干净并烘 十。3.4真空干燥器（温度可调节）3.5氨基酸自动分析仪。4. 试剂全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。4.1浓盐酸：优级纯4.26mo1/L盐酸：浓盐酸与水1： 1混合而成。4.3苯酚：需重蒸馏。4.4混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.0025mo1/L4.5缓冲液：4.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000

3、ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.24.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml, 用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。4.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml， 用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。4.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释 到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。4.6茚三酮溶液4.6.1 pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiOH.H2

4、O）168g，加入冰乙酸（优级纯）279ml， 加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠调节pH至5.2。4.6.2茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液（2.6.1）50ml加入4g 水合茚三酮（C9H4O3.H2O）和0.12g还原茚三酮（C18H10O6.2H2O）搅拌至完全溶解。 4.7高纯氮气：纯度99.99%。4.8冷冻剂：市售食盐与冰按1： 3混合5.操作步骤5.1样品处理：样品采集后用匀浆机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）于低温冰箱中冷冻 保存，分析用时将其解冻后使用。5.2称样：准确称取一定量样品，精确到0.0001g。均匀性好的样品如奶粉等，

5、使样品蛋 白质含量在1020mg范围内；均匀性差的样品如鲜肉等，为减少误差可适当增大称样 量，测定前再稀释。将称好的样品防于水解管中。5.3水解：在水解管内加6mol/L盐酸1015ml （视样品蛋白质含量而定），含水量高的样 品（如牛奶）可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚34滴，再将水解管放入冷冻 剂中，冷冻35min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0psi），然后充入高纯氮 气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解 管放在1101C的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到5

6、0ml 容量瓶内，用去离子水定容。吸取滤液1ml于5ml容量瓶内，用真空干燥器在4050C 干燥，残留物用12ml水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸十，用1mlpH2.2的缓 冲液溶解，供仪器测定用。5.4测定：准确吸取0.200ml混合氨基酸标准，用pH2.2的缓冲液稀释到5ml，此标准稀 释浓度为5.00nmol/50L，作为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定样品测定液的氨基酸含量。6. 计算上机样品液（50mL）中氨基酸量（nmol）=上机标准液（50mL ）中氨基酸量（nmol）X样品峰面积氨基酸标准峰面积所以，100g样品中氨基酸的mg数二上机样品液中氨基酸量（

7、nmol）Xf XMrX100mXVX106式中f-样品的稀释倍数Mr-氨基酸的相对分子量m-样品质量（g）V-上机时的进样量（此处为50mL）7. 其他7.1测定条件（以Beckman-6300型氨基酸自动分析仪为例）缓冲液流量：20mL/h；茚三酮流量：10mL/h；柱温：50、60 和 70C；色谱柱：20cm；分析时间：42min。7.2标准出峰顺序和保留时间序号出峰顺序保留时间/min序号出峰顺序保留时间/min1天冬氨酸5.55 9蛋氨酸19.632苏氨酸6.60 10异亮氨酸21.243丝氨酸7.09 11亮氨酸22.064谷氨酸8.72 12酪氨酸24.525脯氨酸9.63 1

8、3苯丙氨酸25.766甘氨酸12.24 14组氨酸30.417丙氨酸13.10 15赖氨酸32.578缬氨芨16.65 16精氨酸40.757.3允许差：同实验室平行测定或连续两次测定结果相对偏差绝对值W12%。二、食物中胱氨酸的测定方法-氨基酸自动分析仪法（过甲酸氧化）1. 原理在用盐酸水解蛋白质的过程中，胱氨酸易被破坏，现多采用过甲酸氧化法将蛋白质中的 胱氨酸及半胱氨酸氧化成半胱磺酸，其反应如下：SH NH2 O SO3H NH2 OCH2 CH COOH+3H C OOH CH2 CH COOH+3H C OH半胱氨酸 过甲酸 半胱磺酸甲酸生成的半胱磺酸可在氨基酸自动分析仪上进行测定，与

9、标准半胱磺酸比较，计算其含量。2. 适用范围参照中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所编写的食物营养成分测定法第三版。适 用于食物中胱氨酸的测定。3. 仪器水解瓶：耐压螺盖玻璃管或硬质试管，体积2030mL，用去离子水冲净并烘干，电热减 压蒸发器。4. 试剂过甲酸：取9mL分析纯甲酸加入1mL30%过氧化氢混合，在室温放置2小时以上。5. 操作步骤5.1过甲酸氧化：称取一定量的食物样品置于水解瓶中，使样品含蛋白质在510mg，加 入1mL过甲酸试剂，在室温放置3小时。加1mL乙醇终止氧化。将样品瓶置于电热减 压器中，于45减压蒸十，用1mL去离子水淋洗瓶壁，再蒸干，反复3次，以除去过甲 酸。5

10、.2盐酸水解：同食物中氨基酸（16种）测定方法5.3在Bekman6300氨基酸自动分析仪上，在注文50C时用pH3.25柠檬酸缓冲液洗脱， 半胱磺酸的出峰时间约在1.78分钟。6. 计算上机样品液（50l）中半胱磺酸量=上机标准液中半胱磺酸量（nmol）X样品峰面积半胱磺酸标准峰面积100g样品中胱氨酸mg数=上机样品中半胱磺酸量（nmol）XDXMX100WXEX106X2式中D：样品稀释倍数M：胱氨酸分子量（ng）W：称样量（g）E：上机时的进样量（此处为50妇）三、食物中色氨酸的测定-荧光分光光度法1. 原理食物中蛋白质在酸水解过程中，其色氨酸极易被分解，本法用碱水解蛋白质，直接测定

11、色氨酸的天然荧光。在蛋白质水解液中，只有色氨酸和酪氨酸可以检测到荧光。在pH为 11时，色氨酸的荧光强度比酪氨酸大100倍，且两种氨基酸的荧光峰相差40多nm，利 用此特点，可在有大量酪氨酸的存在下，检测色氨酸的含量。2. 适用范围参照中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所编写的食物营养成分测定法第三版。适 用于食物中色氨酸的测定。3. 仪器3.1荧光分光光度计3.2减压蒸发器3.3螺旋盖大口瓶（瓶盖要有橡皮垫）3.4聚四氟乙烯管3.5小玻璃球3.6烘箱4. 试剂（1）5mol/L NaOH:内含0.5%可溶性淀粉，临用前配制。（2）4mol/L 尿素（pH=11）（3）6mol/L 盐酸（4

12、）漠百里酚蓝指示剂：称取0.1g漠百里酚蓝加0.1mol/L氢氧化钠1.6ml，配成0.05% 水溶液。（5）高纯氮（含量99.999%）（6）辛醇甲苯溶液：内含1%辛醇（7）色氨酸标准液：（1mg/ml）：称取色氨酸标准，用0.005mol/L的氢氧化钠溶液溶解， 贮存于冰箱保存。5. 操作步骤5.1称取含粗蛋白质约5mg的食物样品，置于聚四氟乙烯管中，加含可溶性淀粉的5mol/L 氢氧化钠1ml，加入1滴辛醇。5.2将各管分别盖上小玻璃球，放入1只带螺旋盖的大口玻璃瓶中，将瓶置于减压蒸发装 置中，加冰和盐降温，减压至真空度1.3Kpa10mmHg以下，继续保持15min，充氮气再 减压，如

13、此反复3次，迅速旋紧大口瓶的螺旋盖。5.3将充氮气的大口瓶置于烤箱内，在110C水解样品22小时。5.4冷却大口瓶，用重蒸馏水将样品分别洗至25ml容量瓶中，（内含6N Hcl 0.7ml）用漠 百里酚蓝为指示剂调pH至中性，用重蒸水定容至刻度。5.5吸取样品液1ml，于10ml带盖试管内，用pH11的4mol/L尿素溶液稀释至刻度，在 激发波长为280nm，发射波长为360mm下测定荧光强度，根据标准色氨酸的荧光强度曲 线，计算样品中色氨酸含量。5.6色氨酸标准曲线：用前将标准贮备液稀释成每ml含100，200，300，400Mg的色氨 酸标准系列。取每种浓度的标准液各1ml （双份）与样品管同样加试剂，同时水解，以 色氨酸标准浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。6. 计算每100g样品中的色氨酸含量（mg）=AXDX1001000 XW式中A：根据标准曲线得到的每ml测定液中色氨酸的含量（mg）D：稀释倍数W：取样量（克）