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1、植物DNA的提取分离技术 摘要：主要介绍了近年来国内外几种常用的 DNA提取方法：CTAB法.SDS法等，并在对其进行了简单的归纳总结与比较分析同时，并介绍 了一些新的改良方法和其他植物提取方法 关键词 ：植物 DNA 提取方法 研究进展市售中药材大多为干品 , 而中药材的加工和贮藏整个过程 , 如日晒、高温烘干等都不利于 DN的完整性，为达到要求目前国内外研究 发现并使用的DNA提取方法有很多1-12，其中被最为广泛应用的 DNA提取方法是传统的CTAB法和SDS法13。由于不同植物的材料 组分和干湿程度各异，因此对不同植物DNA的提取存在着不同的效果。目前许多学者都在致力于研究不同的植物
2、DNA提取方法。他们在 探索新方法的同时， 也针对不同的植物， 在传统的提取方法上进行着 一些新的改良。1. 十六烷基三乙基溴化铵（CTAB法在目前众多的DNA提取方法中，CTAB法是其中最为广泛应用的 一种。它既可以裂解细胞， 又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的 沉淀，因而经常被应用于植物的 DNA提取工作中。1.1 方法及原理CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide, 十六烷基三甲基 溴化铵 ），是一种阳离子去污剂 , 具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与 酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中 （0.7mol/L NaCl）， CTAB 与蛋白质和多聚
3、糖形成复合物， 只是不能沉淀核酸。 通过有机溶剂抽提，去除蛋白， 多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出 来。1.2 CTAB 提取缓冲液的经典配方Tris-HCI (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或 Mn2离子，抑制DNase活性；NaCI提供一个高盐环境，使DNP 充分溶解，在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便 于分离。B -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变， 使酚容易去除PVP( 聚乙烯吡咯烷酮 ) 是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的 络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖 结合，有效
4、去除多糖。1.3 适用范围及一些改良由于CTAB提取法能够有效地去除多糖及酚类物质的沉淀，因而 适用于从含酚类及糖类物质较高的植物材料中提取DNA经研究发现CTAB提取法在落羽杉属树木、黑木相思、野生稻、野燕麦、枸杞、 花生的DNA的提取中，相比较其他提取方法来说都是最好的提取方 法。为了缩短提取流程，提高提取质量，研究人员在传统方法的基础 上，针对不同植物的特点， 对一些提取步骤进行了改进。 李先进11 在对四种药用蕨类DNA提取的比较研究中发现，由于酚类物质极其容 易被氧化，因此可以在最开始研磨材料的时候加入4%PV，P 以防止研磨中细胞组织破裂后酚的氧化， 从而获得更为理想的 DNA 黄
5、永莲5 首先将材料在4C放置1 2天，以便于其叶片中的多糖类物质的降 解；然后在用CTAB处理的同时加入蛋白酶 K,提高提取缓冲液中B - 巯基乙醇用量，增加氯仿 / 异戊醇的量和使用次数，以及缩短异丙醇 沉淀 DNA2. 十二烷基磺酸钠(SDS法SDS提取法与CTAB提取法一样，也为常用的 DNA提取方法。在 DNA勺提取过程中，有机溶剂的抽提效果及裂解液的裂解效果都是影 响有机物质去除的先决条件， 不同的有机溶剂和裂解液对于不同种类 的植物DNA提取作用也有所差异。所以有很多植物比较适合使用SDS提取法对其进行DNA的提取。2.1 原理和方法CTAB(hexadecyltrimethyla
6、mmonium bromide, 十六烷基三甲基 溴化铵) ，是一种阳离子去污剂 , 具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与 酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中 (0.7mol/L NaCl),CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸 . 通过有机溶剂抽 提，去除蛋白、 多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出 来。注：CTAB溶液在低于15C时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰 冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15C。2.2 缓冲液配方2.2.1 CTAB提取缓冲液的经典配方：Tris-HCl (pH8.0) 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg
7、2+或 Mn2离子，抑制 DNase活性；NaCI提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；B -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚 容易去除。2.2.2 CTAB 提取缓冲液的改进配方：(1) PVP( 聚乙烯吡咯烷酮 )是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖 结合，有效去除多糖；(2) 蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS异硫氰酸胍 等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化；(3) 多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2 体
8、积的5M NaCI,高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提 取缓冲液中加一定量的氯苯 (1/2 体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用， 从而去除多糖。用PEG8OO0弋替乙醇沉淀DNA在500卩L DNA液中 加入 200 卩 l 20% PEG8000 (含 1.2 M NaCl)，冰浴 20min.核酸分离， 纯化；(4) 多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：B -巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力， 可防止酚类与DNA的结合；(5) 盐离子的去除： 70%的乙醇洗涤核酸吸附 ,
9、 沉淀和溶解使用合适的 吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一 种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉 淀RNA吸附或沉淀后应用70%勺乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储 存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2或Mn2离子，抑 制DNasepH直为8.0，可防止DNA发生酸解。2.3 适用范围及一些改良在对老芒麦的基因组 DNA分离的研究试验中，SDS提取法是一种 快速、简便、有效的基因组DNAJ、量提取法。另外，在一些研究中还 发现，SDS提取法能替代操作过程较烦琐的大量法提取基因组DNA从而给研究工作带来便利。在毛白
10、杨成熟叶片基因组 DNA提取的研究 中李继东7通过比较发现，SDS提取法是提取出质量高纯度高的 毛白杨成熟叶片DNA的最佳方法，同时发现，如果将PVP添加到裂解 液中，可以大大减少了试验的操作步骤，提取效果同样很好。另外也 有研究发现，SDS高盐介质法又较常规SDS法省去了添加液氮研磨和 水浴加热抽提等操作，可使得 DNA提取试验的操作变得简便快速3. 高盐低pH法运用高盐低pH提取法对植物的DNA进行提取也较为普遍，此方 法所用的试剂仅有无机盐和异丙醇，而醋酸钾又是常用的无机盐试 剂。由于高盐低 pH 提取法没有反复抽提的过程，其所需要的试验材 料也较少，因此比较适合应用于濒临灭绝的濒危物种
11、植物的DNA提取。郝朝运8在对忍冬科部分植物 DNA提取方法的研究中发现， 用高盐低 pH 法能有效地防止组织破碎及沉淀时的电离化作用和酚类 化合物的进一步氧化，避免了采用酚、氯仿等有毒试剂，同时低 pH 的醋酸钾溶液也是有效的蛋白质沉淀剂。 在高盐提取缓冲液中加入一 定量的B -巯基乙醇，则可有效去除木本植物中含量较多的酚类物质， 从而提高提取DNA勺质量。所以该方法尤其适合以一年生或两年生枝 条为材料提取的植物总DNA不但纯度高、产量大，而且所用试剂无 毒、操作简便。最重要的是，本方法所用植物材料（枝条）不受季节 限制，容易获得和保存，具有较高的实际操作意义。4. 植物DNA勺其他提取法4
12、.1 改良尿素法通过大量试验后，曹文波 9研究出了改良尿素法，在原尿素 法基础上在裂解液中添加B -ME、用预冷的无水乙醇取代异丙醇沉淀 核酸、采用水平离心和快速倒出用于洗涤的乙醇等操作。 并从玉米和 水稻叶片中提取出了高质量的基因组 DNA此种方法的DNA产率高、 快速省时、 可在常温下进行操作且成本耗用低。 所以用改良的方法能 够获得纯度高、浓度大的基因组 DNA。4.2优化的植物总DNA提取方法黄萱10 改进了 Clark利用CTAB提取植物基因组DNA勺方法， 在试验过程中， 通过在研磨材料时加入液氮、 用剪去端部的吸头转移 含有DNA勺溶液，并且将加入RNaseA消化RNA勺步骤改在
13、最后进行 等一系列改进，以获得高质量的 DNA郭红媛、佘茂云11对CTAB 法与SDS法进行了总结，研究出了一种适于棉花总 DNA勺提取方法， 得到的DNA满足分子生物学的进一步研究的需要，效果显著。5 讨论关于植物DNA的提取方法虽然前人已经做了大量的研究， 也总结 出很多诸如CTAB法、SDS法、改良尿素法、苯酚法（根据内宫博文 14等的方法加以改进）等适用范围不同的植物DNA提取方法。苯酚 法是DNA的提取中应用较为广泛的方法，其对新鲜样品的提取效果比 较好,但饱和酚容易氧化，平衡时操作较为繁锁。CTAB是一种阳离子 去污剂 , 既能有效的裂解植物细胞壁 , 又能去除多糖类物质。 从本实
14、验 及其他报道来看，其对于许多新鲜植物基因组DNA的提取是较为适用 的,但对干品中药材的DNA的提取纯度不高4。低pH值法中的提取 介质能有效防止组织破碎及沉淀大量材料时电离化作用及酚化合物 进一步氧化15,所得DNA纯度高,产率高,无须进一步纯化，可直接 进行PCRT增。参考文献1Doyle J J,Doyle J L. A rapidDNAisolationprocedureforsmallquantitiesof fresh leaftissueJ.PhytochemBull,1987,19: 11-15.2DellaportaS L, Wood J,Hicks JB. Aplant D
15、NAmini-preparation:version II J.PlantMolBiol Rep,1983(1):19-21.3 Aras S, Duran A, Yenilmez G. Isolation of DNA for RAPDanalysis from dry leaf material of some Hesperis L.Speci-mens J. Plant Mol Biol Rep, 2003,21: 461- 4614 曹 晖,毕培曦,邵鹏柱,等.中药材苦地胆的DNA指纹鉴定J. 中药材, 1996, （12）: 6105 黄永莲，刘媛，黄真池.植物总DNA勺提取方法的改进J. 湛江师范学院学报， 2007， 28，（3）： 25-30.6 袁燕，王德斌，郭丽红.对改良CTAB对蒜头果基因组DNA 提纯效果的影响的研究 J .云南民族大学学报， 2008， 17 ， （ 2）： 143-146.7 李继东，梁启伟，吴文娟.毛白杨成熟叶片基因组DNA提取 方法的比较研究 J. 河南科学， 2009， 27，（3）：285-288.8 郝朝运，刘鹏，郭卫东.忍冬科部分植物DNA提取方法的研 究 J. 浙江师范大学学报（自然科学版） ， 2006， 2（1）：9
