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1、循环肿瘤细胞检测的现状及发展作者：上海市第一人民医院检查科李莉专家恶性肿瘤远处转移是临床上实体恶性肿瘤治疗失败或复发的重要因素之一。而循环肿瘤细胞的存在正是实体恶性肿瘤远处转移的本源。肿瘤远处转移的最典型根据是88年Pet1提出的“种子和土壤”学说,该学说觉得肿瘤转移的发生和发展,是处在活跃或活化状态的肿瘤细胞作为“种子”,当遇到适合的器官、组织的基质环境，即“土壤”时，就会在此定居、生长即发生肿瘤的转移,从而部分解释了肿瘤原发灶与转移灶之间的关系。但原发部位的肿瘤(种子)是如何达到远处器官或组织（土壤）的这一问题始终困扰着人们。直到1869年,托马斯阿什沃思(Tomas Ashrth)在1例
2、转移性癌症患者血液中观测到了外周血循环肿瘤细胞(ulatin Tumor Cl，CC)从实体瘤中脱离出来并进入血液循环的肿瘤细胞。她推测，这些细胞在癌症转移过程中发挥了非常重要的作用，并也许提供疾病进展的有关信息,CTCs的概念初步形成。据记录，0%以上的肿瘤病人死于肿瘤的转移和复发,实体肿瘤或转移灶的肿瘤细胞在特定条件下,通过上皮-间质转化(eithlial-esenhymatrantion,EMT），从形态上发生向间充质细胞表型的转变并获得迁移的能力。间充质细胞与上皮细胞相邻,只是其构造松散,缺少细胞连接（cel dson)和细胞极性,并且具有转移和侵袭能力。因此,脱落的CTCs得以进入外
3、周血液循环，这是肿瘤发生转移的必要前提。脱离原发灶入血的TC至少面临着血流剪应力、失巢凋亡、免疫细胞辨认杀伤等三重致命考验，进入循环的大部分肿瘤细胞都会失去活性,只有局限性0.0可达到远端器官，通过迁移、粘附、互相汇集形成微小癌栓,并在适合的微环境条件下,CTC又发生间质上皮转化（esenlepitheialransitio,MET)，生成新的肿瘤,从而导至肿瘤转移的发生。从提出Cs概念近一种多世纪的时间里,由于初期实验条件、技术的限制以及学者对TCs的结识的局限性，CC检测及临床应用进展不大。直至上世纪末特别是本世纪初,随着分子生物学、计算机技术的发展,免疫标记技术以及分子生物学技术的突飞猛
4、进，TC分离及分析鉴定技术得以迅速发展,CT检测和临床应用获得了重大进步,为初期发现肿瘤的复发转移、评估手术、放疗、化学等疗效、判断预后、拟定肿瘤分子特性、选择合适的个体化治疗等方面提供了重要的实验室根据。目前，学者所共识的循环肿瘤细胞的概念是:自发或受外界因素作用（如诊断操作等）由原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞。肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是肿瘤转移的最初阶段,并为最后形成肿瘤转移灶提供了也许。进入循环系统的肿瘤细胞大部分在机体免疫辨认及杀伤等作用下发生凋亡，有很少数肿瘤细胞在循环系统中存活下来，在一定条件下，进入血液循环而未被清除的肿瘤细胞通过迁移、黏附、互相汇集形成微小癌栓
5、，并在一定条件下发展为转移灶3。本文拟就Cs分离技术、分析鉴定技术、临床应用、CTCs重要分析仪器作一简介。1 循环肿瘤细胞分离富集技术越来越多的分子生物学和临床研究成果表白，肿瘤转移很也许在肿瘤发生的初期就已经浮现，在外周血中检到TCs是预示肿瘤转移最直接、重要的措施,在肿瘤初期转移的临床诊断、预后判断、监测疗效等方面具有重要意义。CTC的发既有望变化临床上仍依赖于影像学检查及老式肿瘤标志物的现状。由于外周血中的CTCs含量极为稀少，一般觉得在外周血中大概10107个单核细胞中才有一种TCs，因此,对Ts检测技术的敏捷度和特异性提出了极高的规定。目前多种CTCs的检测系统重要涉及CCs分离和
6、富集系统以及TCs的检测和鉴定系统。而分离和富集系统对检测外周血的CTC是非常必要的。抱负的Cs分离与富集及检测技术应能达到如下六点规定：（）高捕获率或高敏捷度,就是可以将样品中的CTCs尽量多的分离出来,即至少可以在上亿个血循环细胞中发现一种肿瘤细胞；(2)高特异性，规定检测成果精确无误，尽量减少假阳性或假阴性，目的是分离出来的细胞只有CCs，其他细胞的含量很少或没有；()规定TCs不能被污染,收集到的CC可以进行表型和基因型分析；（4)高通量,即能在短时间内解决大量样品;(）反复性,回收率高。(6）尽量减少成本5、6。目前用于临床实验研究的CTCs分离和富集技术非常之多，一般来讲根据其物理
7、性质和基于亲和性与辨认的生物性质以及两者综合运用可提成类。但目前来说仍没有抱负的措施,每种单独的措施均有自己的优势和缺陷。虽然两种或三种措施的结合有也许成为较为抱负的措施,但近十几年的研究进展不大。1. 密度梯度离心法（Densty radent Cetrfuatio，DC）密度梯度离心的原理是基于血液中多种正常细胞与CCs密度的差别,运用其在密度梯度介质（如icollqu介质、Onceuick系统）中的沉降系数不同,将细胞悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力的作用,用分离液将Ts与其他细胞层分离。离心后在细胞分离液中多种细胞呈现梯度分布，依次为:血浆成分、单个核细胞（淋巴细胞、单核细胞
8、、肿瘤细胞等)、分离液、中性粒细胞和最下层的红细胞,从而获取目的细胞。有报道用Onceui系统分离肿瘤细胞得到了62倍的富集效果,标明该系统对CCs的平均回收率高、富集效果好，而采用Ficoll-Paque介质只有.8倍。DGC措施操作简便、成本低，但该分离措施一般规定血量较大，且敏捷度和特异性均较低，且在操作过程中也许会损失TCs。12细胞过滤技术(Iolato b Size of Epihelil Tumr ells，IS）IE措施的原理是基于细胞大小不同和机械性能的差别。一般觉得,肿瘤细胞的直径为530m,不小于绝大多数血细胞的直径(如红细胞59m),根据细胞大小所设计的滤过膜滤过血液样
9、本后将直径大的肿瘤细胞分离出来。但由于目前还没有报道证明所有肿瘤细胞直径都不小于,使其分离敏感性受到质疑。该措施对技术、设备规定不高，但会丢失一小部分直径不不小于滤膜孔径的CTCs，导至检测敏捷性减少。.3 细胞粘附技术(Celadhesiontechque，CAT)细胞粘附分离技术是Cs捕获的一项基本技术,运用的是亲和反映原理,即运用CC与生物生化修饰或物理修饰捕获表面的亲和作用,具有CTCs的样本通过捕获表面时，CTC则被吸附在捕获表面,随后冲洗掉未被粘附的非目的细胞，从而得到CTCs。此后发展起的多种纳米及微流控技术都采用了这一基本技术。1.免疫磁珠分离技术（Immunmetc sart
10、ion,IMS）与一般血细胞相比，CTC具有某些特殊的生物标志物,涉及Ts表面的上皮细胞粘附分子（Ephelial cel adhesion molecle,EpCM)、细胞角蛋白（ytokeatin，CK)以及肿瘤特异性抗原，而血液中几乎所有的细胞都是反磁性或弱磁性的,运用肿瘤细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合，继而在外加磁场中通过相应抗原抗体复合物与磁珠吸附而滞留在磁场中或定向移动到指定区域,没有表面抗原的其他细胞由于不能与连接磁珠的特异性单克隆抗体结合而不能在磁场中停留，从而使肿瘤细胞得以从血液中分离出来7。该措施的敏感性一定限度上受到CTCs表面抗原体现的制约。例如：采
11、用EpCAM抗体捕获TC，由于EpA在s的体现率一般为60-70%，往往会丢失部分CCs;单一的C抗体也不能完全辨认癌细胞体现的所有CK;在TCs上皮间质化过程中,某些基于原则化上皮标志物的筛选抗体无法检测出所有CTC等等。这一切都受到目的抗原的体现量与特异性以及与相应抗体的结合能力影响。.5纳米基质分离技术（Nanoipin matix isolation echnoog）纳米技术在纳米尺度对检测物质进行检测和操作,是一门融合化学、生物学、物理学和药学的交叉学科。通过在基底表面制备纳米构造设计细胞界面,并修饰相应的特异性辨认分子，可以将血液中的TCs捕获并分离出来。陆宁宁等综述了据此思路研发
12、的技术设备有:（1)纳米柱、纳米线及纳米纤维：在CCs捕获装置中,纳米柱、纳米线及纳米纤维基质均可通过多种方式获得。如运用湿法刻蚀或化学气相沉积法可制备纳米柱或纳米线基质;(2）纳米粗糙表面：由于TCs的黏附性较血液中其他细胞强,因此粗糙界面的构建为Cs高效分离提供了此外一种选择;(3)碳纳米材料：以碳纳米管、石墨烯为代表的碳纳米材料因具有高比表面积、优良的导电性能和良好的生物相容性等特点,成为了生物传感器、储能材料、药物载体以及高分子等领域中的常用材料；(4)仿生材料：自然粒子如哺乳动物细胞和花粉,因具有独特的拓扑构造而呈现众多优良性能。以这些复杂构造的自然粒子为模板,可制备具有相应构造的仿
13、生材料。相对于老式的CTs分离法的分类效率及特异性有了极大的提高，并且制备简朴，不需要复杂昂贵的微加工设备。1. 微流控芯片技术(Micrfluidiccip tclogy）微流控芯片技术(icroflidi)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反映、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上， 自动完毕分析全过程。微流控技术可在微米构造中操控纳升至皮升体积液流,是近年来迅速崛起的集生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。基于微流控芯片的CTCs分离技术通过在芯片通道内部修饰可辨认的细胞表面抗原的抗体或核酸适配体,当通入含CTs的样本时，CC与通道表面捕获
14、试剂结合,实现特异性分离。该措施所需样品量小，无需对血液样品进行前解决，且流动的流体环境有助于清除非特异性吸附的其他细胞,从而提高分离纯度。Dhaaii等9采用包被了pCAM抗体和抗PSMA核酸适配体的芯片从血液样本中分离了不同的CTC,其捕获率不小于9%,纯度达到100，如将芯片通道中的平的捕获表面用抗体修饰的纳米构造表面替代，CTCs捕获率甚至可以提高到95%。微流控芯片是一种集样品制备、反映、分离、检测等功能于一体的小型分析实验平台。最早用于制作微流控芯片的材料重要是石英、玻璃及单晶硅片,随着技术的进步，一系列有机聚合物如聚二甲基硅氧烷(Polyiethylsioxane，P)、聚甲基丙
15、烯酸甲酯（olymthyMehacyate,MA）、聚碳酸酯（Polcaboat,PC)等材料已发展成为芯片制作的常用材料。目前根据微流控技术使用的原材料可分为基于硅材料的微流控芯片、基于DMS玻璃的微流控芯片、基于热聚膜的微流控技术（如PMMA）、基于微流控芯片平台的磁分离技术、基于微流控芯片平台的微纳米基质分离技术等7。除微流控芯片技术外,微流控技术（rofluidis)还在其他循环肿瘤细胞分选富集措施中,获得了迅速发展。在微流控器件中从血液样品注入到循环肿瘤细胞分选可以实现持续的过程,极大地简化了操作程序，并可减少目的细胞的损失。黄笛等根据作用方式将微流控分选富集技术分为被动分选和积极分选两大类:被动分选技术涉及微构造过滤、场流及水力分选、拟定性侧向偏移、惯性分选、仿生分选、亲和性分选等措施，一般具有通量高、不需要额外施加作用立场的长处；积极分选技术涉及介电泳分选、磁分选、声分选、光分选等措施，一般具有分选精度高的长处10。2循环肿瘤细胞检测技术通过上述措施分选富集的T
