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1、5月9日更新：real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程中文翻译版（请同时参考英文原版）请注意：体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。美国CDC实时町PCR（rRTPCR）检测猪流感操作规程（2009版）本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用 本规程不用作商业活动或赢利目的。一、概 述（一）前提本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。（二）实验原理实时荧光定量RTPCR（rRTPCR）法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引 物和双重标记的TaqMan探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定 性检测鉴定In
2、fA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的 呼吸道样本。（三）使用条件一 步 法 定 量 R T - P C R 9 6 孔 板 热 循 环 系 统样本处理应在相应的生物安全实验室完成。（五）样本要求1、呼吸道样本 支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所 用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉 头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。2、排除标准1）未在2-4C心 天）或-70及
3、以下保存的样本2）以上未列的其它不当样本（六）核酸提取RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检 验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp 病毒RNA提取试剂盒，RNeasy 小试剂盒（QIAGEN公司），罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒，MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II,和罗氏 MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA。（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。二、实验材料（一）试剂1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；2、分子级无菌蒸馏
4、水（无RNA酶和DNA酶）；3、正反向引物（40型）;4、双重标记探针（10型）;5、阳性对照。二）供给1、实验室标记笔；2、微量离心管格栅，96孔0.2ml PCR反应管；3、20pl和200pl可调节移液器及滤芯枪头；4、0.2ml PCR 反应管盘；5、光学反应盖板；6、无菌，无核酸酶的1.5 ml微量离心管；7、一次性无粉手套。（三）仪器设备1. 微量离心机；2. 漩涡振荡器；3. 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。三、操作程序（一）准备工作1. 避免样品污染由于fluorogenic 5核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。推荐 以下预防污染的方法：1）实验准备
5、与核酸提取使用独立区域；2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；4）不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。2、仪器准备工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzaptm”或者RNase AWAY 来减小核酸交叉污染的风险。3、试剂准备注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。1）引物和探针（1 ）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8可保存 多达3个月，不要对探针反复冻融）；（2）涡旋振
6、荡引物和探针；（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。2 ） Real time RT-PCR的试剂（1 ）将Master Mix和酶置于冰架上；（2 ）融化2x的Reaction Mix ;（3 ）颠倒混合2x的Reaction Mix ;（4 ）瞬时离心2x的Reaction Mix和酶，置于冰架上。4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测1）每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA, swFluA, Swine Hl （swHl）和RNaseP （RP）。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因 为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。2 ）对于每一
7、个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC） 和阳性模板对照（PTC）。3 ）人类样本对照（HSC ）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和 试剂的完整性。5、建立反应 反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。然后在适当的实验反应和对照中，加入水和提取的核酸或者阳性模板对照（PTC）。1 ）为每一个引物和探针标记一个1.5m I的微量离心管；2 ）对每一个建立的反应确定反应数（N）。考虑到NTC、PTC、HSC反应和吸量误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：（1）如果包括对照，样品的数量（n ）为1到14，那么N = n + 1 ；（2 ）如果包括对照，样品的数量（n
8、 ）大于15，那么N二n+2。3 ） Master Mix:计算加到每个引物/探针反应混合物中的各个试剂的量。计算如下：*体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。4）加入水之后，通过上下吹打混匀反应混合物，不要涡旋振荡。5 ）离心5s使混合物聚集管底，然后将管子置于冰架上；6）准备板状的反应管子或者96孔板，置于冰架上；7 ）每一个master mix吸取20pl到每一孔中，每排按顺序进行，如下图:实验建立举例：12456789101112AInfAInfAInfAInfAInfAInfAInfAInfAInfAInfAInfAInfABsw InfAsw InfAsw InfAsw
9、 InfAsw InfAsw InfAsw InfAsw InfAsw InfAsw InfAsw InfAsw InfACswH1swH1swH1swH1swH1swH1swH1swH1swH1swH1swH1swH1DRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPEInfAInfAInfAInfAInfAInfAInfAInfAInfAInfAInfAInfAFsw InfAsw InfAsw InfAsw InfAsw InfAsw InfAsw InfAsw InfAsw InfAsw InfAsw InfAsw InfAGswH1swH1swH1swH1swH1swH1swH1sw
10、H1swH1swH1swH1swH1HRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRP实验样本举例：123斗56789101112ANTCSIS3S5S7S9SilS13S15S17S19PTCBNTCSIS3S5S7S9SilS13S15S17S19PTCCNTCSIS3S5S7S9SilS13S15SI 7S19PTCDNTCSIS3S5S7S9SilS13S15S17S19PTCES2S4S6S8S1OS12S14S16S18HSCFS2S4S6S8S10S12S14S16S18HSCGS2S4S6S8S10S12S14S16S18HSCHS2S4S6S8S10S12S14S16S18H
11、SC注意：在任何样本被加入之前，应该首先加入阴性模板对照（NTC）（第1列），用来检验master mix中的污染。HSC应该在待测样本之后加入（第11列）， 用来检验在样本准备或者加入过程中的交叉污染。阳性模板对照（PTC ）应该在 所有样品和阴性模板对照（NTC ）之后被加入。8）在将培养板移到核酸处理区域之前，在试验设定区域，在反应板的第一 列将NTC反应进行。如上所述。9 ）吸取5pl的nuclease free water到NTC孔，将NTC孔盖上。10）将反应板盖上，移到核酸处理区域。11）将含有样品的管子涡旋振荡5s,瞬时离心5s ;12）将提取的核酸样本置于冰架上；13 ）如上
12、所述，样品应该按列加入，吸取5pl的第一种样本到所有标记这种 样品的孔中（例如，样本“S1”如上表格所示）。不同样本之间需更换枪头操 作。14）加完样本的孔要盖住，这将会帮助防止样品的交叉污染，并且能够使操作人员记录其加样的具体进程；15）为了避免交叉污染，必要时更换手套；16）对剩下的样本，重复步骤13-15；17 ）加入5pl的HSC样品加到HSC孔中（第11列）。将HSC孔盖盖。18）最后，加5p I阳性模板对照RNA到所有PTC孔中，将PTC孔盖上。19 ）如果使用8个管子的条状板子，每一条都要做标签标记，来指明每一个 样品的位置（不要在反应管子的顶部标记！）。瞬时离心条状管子10 -
13、15s,然 后置于冰架上。如果使用培养板，4C, 500g离心30s，置于冰架上。6、RT-PCR扩增条件反应体系为25ul，反应条件如下:Reverse Tianscription50C for 30 niinTaq liiliibitor activation95C for 2 linnPCR amplification (45 cycles)95C for 15 sec55C. for 30 sec具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。1）探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如 果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染
14、。 那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。2）在37个循环处或者37个循环之前，所有的临床样本的RP反应曲线都 应该超过阈值线，这表明从人类RNase P基因扩增到足够量的RNA，也表明了 样本质量合格。然而，可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无 法出现阳性结果。同时，从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本，经常会注：在55度这一步骤中要收集荧光信号（FAM ）RP反应没有结果或者结果很弱。如果在所有临床样本中检测RNase P都阴性， 则说明：（1）从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标 本的RT-PCR抑制剂的残留污染；（2）没有足够的人类细胞以备检测；（3）方法建立和实施不当；（4）试剂和仪器原因。3）在40个
