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1、革兰氏染色一、目的：在细胞发放之前，利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测，判 断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。二、原理： 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合 物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇 脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现 缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性 菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后， 以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的 溶出，因此通过乙
2、醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴 性菌呈红色。三、实验用品准备：灭菌玻片、 10-100ul 移液器、 10-100ul 灭菌移液吸头、 100ul-1000ul 移液器、 100ul-1000ul 移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显 微镜、香柏油、擦镜纸、计时器四、操作：1 涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取 10ul 待检样品滴在载玻片的中央， 用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。2 干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤
3、枯而变形。3 固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回 通过 2-3 次，共约2-3 秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60C）,放置待冷后，进行染色。4初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1 -2滴，使染色液覆盖涂片，染色约lmin。5 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。6 媒染：用 100-1000ul 移液枪吸取约 300ul 碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约 1min。7 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。8 脱色：斜置载玻片，滴加 95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时 20-30S，随即水洗。9 复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液 1-2 滴，使染色液覆盖涂片，染色约 1min。10 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。11 干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目 的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏 阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。五、清场：1.实验结束后，将显微镜油镜上的残留的香柏油用擦镜纸轻轻擦去，将载物台移至最底处将灯光调到最暗并将其关闭电源，拔下电源插头，罩上防尘罩。
