原核表达实验

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1、原核表达操作流程实验概要本实验介绍了原核表达的具体操作流程，包括：外源基因的诱导表达，大肠杆 菌包涵体的分离与蛋白质纯化。实验原理1. E. coli表达系统E. coli是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E. coli菌株以后，通过 温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。2. 外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表 达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实 验米用异丙基硫代-0 -D-半乳糖昔(IPTG)诱导外源基因表达。不同的表达质粒表达方法并不完全相同，

2、因启动子不同，诱导表达要根据具体 情况而定。主要试剂1. 诱导表达材料1) LB (Luria一Bertani)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Dis tilled wa ter) 1000ml pH 7.0 适用范围：大肠杆菌2) IPTG贮备液：2 g IPTG溶于10 mL蒸馏水中，0 22卩m滤膜过滤除 菌，分装成1 mL /份，一20 C保存。3) IX凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS

3、(电泳级)0.1 %溴酚蓝10 %甘油2. 大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1) 酶溶法a. 裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaClb. 50 mmol / L苯甲基磺酰氟（PMSF ）。c. 10 mg / mL 溶菌酶。d. 脱氧胆酸。e. 1 mg / mL DNase I。2）超声破碎法a. TE缓冲液。b. 2XSDS -PAGE凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI （ pH 8 . 0 ）100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 %溴酚蓝20 %

4、甘油主要设备1. 超净工作台2. 超声破碎仪3. 电泳设备4. 移液枪5. 培养皿实验步骤1. 外源基因的诱导表达1）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。2）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。3）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱， DNA序列测定，确定无误后进行下一步。4）如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30 -32C培养数小时， 使培养液的OD60达0.4-0.6，迅速使温度升至42C继续培养3 -5h ；如果表 达载体的原核启动子为tac等，则37C培养细菌数小时达到对数生长期后加 IPTG至终浓度为1 mmol /

5、L。继续培养3 -5h。5）取上述培养液1 mL , 1000g离心，1 min，沉淀，加100 “L聚丙烯 酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS -PAGE检测。2. 大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1）细菌的裂解常用方法有：高温珠磨法；高压匀浆；超声破碎法；酶溶法；化学渗透等。前 三种方法属机械破碎法，并且方法高温珠磨法、高压匀浆已在工业生产中得到 应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎 法的实验步骤。a. 酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；p -1,3 -葡聚糖酶；p -1,6 -葡聚 糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几 种酶对酵

6、母作用显著。主要步骤为： 4C, 5000rpm离心，15 min，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃上清，约每克湿菌加3 mL裂解缓冲液，悬浮沉淀。 每克菌加8p L PMSF及80p L溶菌酶，搅拌20 min ；边搅拌边 每克菌加4 mg脱氧胆酸（在冷室中进行）。 37C，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20p L DNase I。室 温放置至溶液不再粘稠。b. 超声破碎法。声频为15-20 kHz的超声波在高强度声能输入下可以 进行细胞破碎，在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染 色体DNA进行剪切，大大降低液体的粘稠度。 收集1 L诱导表达的工程菌，40

7、C，5000r pm离心，15 min ； 弃上清，约每克湿菌加3 mLTE缓冲液。 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10 000g离心，15min，分别收集上清液和沉淀。 分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2X凝胶电泳加样缓冲液, 进行 SDS -PAGE。注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有 关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3 -4次冻溶后更容易破碎。2）包涵体的分离蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成相差显微镜下可见到的细胞质颗粒，即 为包涵体，经离心沉淀后可用Triton-X100 / EDTA或尿素洗涤，若为获取可 溶性的活性蛋白，须

8、将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。a.试剂与配制 洗涤液I:0.5 % Tri ton X -10010 mmol / L EDTA （ pH 8 . 0 ）溶于细胞裂解液中。 2X凝胶电泳加样缓冲液。b.细胞裂解混合物12 OOOg离心，15 min , 4C；弃上清，沉淀用9X 洗涤液l悬浮；室温放置5 min ; 12 OOOg离心15 min , 4C；吸出上清， 用100卩L水重新悬浮沉淀；分别取10卩L上清和重新悬浮的沉淀，加10 M L 2X凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS-PAGE。3) 包涵体的溶解和复性a. 试剂与配制 缓冲液I：1 mmol / L PMSF8mol /

9、L尿素10 mmol / L DTT溶于前述裂解缓冲液中。 缓冲液II：50 mmol / L KH PO241 mmol / L EDTA ( pH 8 . 0 )50 mmol / L NaCI2 mmol / L还原型谷胱甘肽1 mmol / L氧化型谷胱甘肽 KOH 和 HCI。 2X凝胶电泳加样缓冲液。b. 用100 m L缓冲液I溶解包涵体；室温放置lh ；加9乂缓冲液II, 室温放置30 min，用KOH调pH到10.7 ；用HCI调至pH 8 . 0，在室温放 置至少30 min; 1000g离心，15 min，室温；吸出上清液并保留，用100 M L 2X凝胶电泳加样缓冲液溶解沉淀；取10 m L上清，加10 M L 2X凝胶电泳 加样缓冲液，与20 m L重新溶解的沉淀进行SDS-PAGE。注意事项1. 不同的大肠杆菌表达载体带有不同的启动子和诱导成分。实验者必须根据特 定系统和用途决定相应的实验方案。2. 表达和检测时，应设置对照组，如转化载体和非诱导细胞。3. 由于大肠杆菌中表达的重组蛋白质缺少哺乳动物细胞特异的翻译后加工，所 以，其生物活性无法与天然蛋白质相提并论。