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1、第五节 加单氧酶系及其诱导作用在生物医学领域内，人们对药物在哺乳动物体内经由一定的生化机制进行的生物转化作用，已经给与了极大的关注，对来自哺乳类的细胞色素P450电子传递系统进行了广泛的研究。该系统涉及许多类型药物的氧化作用，例如：芳香及脂肪族化合物的羟基化；N，O和S去烷基化，以及S和N氧化作用。Smith和Rosazza详尽地综述和比较了微生物和哺乳类地药物代谢系统，考虑了所有上述提取的反应以及还原和水解转化、结合作用。目前，在微生物和哺乳类代谢系统中最引人入胜的相似点，或许莫过于它们各自的细胞色素P450均一蛋白加单氧酶系。下面就简要地介绍微生物和哺乳类之间这种外线粒体电子传递系统的异同
2、点，目的在于提供一种对于药物代谢研究中运用微生物模型的明晰的生物化学关系。一、加单氧酶细胞色素P450的重要性哺乳类生物转化过程中相反应的三种类型是最普遍最重要的。在过去的二十年间，人们对各种类型化合物氧化机理的了解，取得了惊人的进展。Hayaishi的“氧化酶”一书对氧代谢的总体方面进行了详尽的讨论。此后，围绕着氧的活化，氧化酶类的生理功能等机理研究方面研究了许多复杂问题，下面就是近期工作的小结。大多数哺乳类氧化相反应，都是由细胞色素P450连接主要位于肝脏的加单氧酶，单也存在于肾脏、肺、胃肠道、脾脏和甾体生源器官，如肾上腺皮质、睾丸、卵巢及胎盘。细胞色素P450实际上是一类涉及多种类型化合
3、物氧化代谢活性体系的均一蛋白质，与这种均一蛋白有关的肝脏混合功能氧化酶。在这一光谱基质的氧化作用中需要NADPH和分子氧。通常肝脏的酶固结在膜上，它们出现在当组织消化和差速离心处理所得到的颗粒性的微粒体部分。肝脏P450系统的颗粒本质和相当的不稳定性，使得难于分离，并在纯净状态下工作。通过精巧的电子传递链，包括均一蛋白P450，一种类似于细胞色素P450还原酶的黄素蛋白的作用下，基质的氧化作用就发生了，也需要一种磷脂，如卵磷脂。除肝脏外的细胞色素P450系统常常是水溶性的，在天然基质的氧化中需要一种非均一的铁硫蛋白和NADH，如：甾体化合物即是如此。当分离得到的细胞色素P450，用连二亚硫酸钠
4、处理，就被还原，再用一氧化碳处理，就在450nm的中心峰产生了一差别吸收峰。这样，由Omura和Sato定名为“细胞色素P450”。后来的研究证明了在多种有机化合物的羟基化期间，在分子氧的活化中均一蛋白质是功能性的。存在着许多非常相关的细胞色素，它们可能彼此通过对一氧化碳的差别吸收谱而区别开，其精细差别出现在最大吸收值446和452nm之间，对所有这些均一蛋白质之间的确切功能差别还不完全了解。人们已经付出了相当的努力来探讨通过这种加单氧酶系催化的、尚未揭示的电子传递过程所伴随的氧化作用。细胞色素P450加单氧酶结合基质和分子氧，同还原酶先后两步相互作用到活化氧。最终一个氧原子并入基质，另一个氧
5、原子被还原成水。图36就描述了由P450系统所涉及的基质氧化作用系列循环过程。在这一循环中，形成的P450外来化合物O2三元络合物阐明从细胞色素P450加单氧酶给与的选择性，在该途径中NADPH细胞色素P450还原酶涉及两步序列（二电子），如图所示，也发生了NADH的电子转移，NADH的协同作用、细胞色素b5还原酶和细胞色素b5也在图36表示出来。人们提出这些系统的过氧化氢的偶联和解偶联作用。看来NADPH（和NADPH发生系统）可能被过氧化氢和由某些微粒体混合物及某些纯化了的细胞色素，对某些外来化合物的氧化作用中产生的各种有机过氧化物所取代。显然，这种观察还没有被同等的微生物体系所复现。过氧
6、化物的效应可能支持这种假定的P4502+O2-络合物中间体（见图36）。图36 外源化学异物经由P450偶联加单氧酶的氧化作用人们相信细胞色素P450加单氧酶系作用于哺乳类的脂肪合芳香族的羟基化，N、O和S去烷基化和某些S和N的氧化作用。一般而言，我们可设想它们由缺少电子的氧原子对基质起反应。芳香族的羟基化经由芳烃氧中间体而完成。在多数情况下，N、O和S脱烷基化作用是不稳定的，以至于它们同时分解为去烷基基质和一种相应的醛。二、微生物的细胞色素P450系统微生物的加单氧酶系也包括细胞色素P450均一蛋白和其它在基质氧化中起本质作用的有关因子。在细菌发现的该酶系同在酵母和真菌中发现的具有很大差别。
7、原核生物看来具有加单氧酶系（即细胞色素P450，黄素蛋白还原酶，非均一的铁硫蛋白），它十分类似于在肾上腺线粒体发现的加单氧酶系，与此相反，真核微生物（酵母和真菌）具有的加单氧酶系更类似于哺乳类肝微粒体中所发现的该酶系。许多微生物细胞色素P450相关本质的情报，已总结于表6。微生物的这些加单氧酶系在如像碳水化合物、脂类、甾醇类和链烷类的中间代谢中起了重要的作用。又如：在固氮过程，生物碱的合成，棒曲霉素的生物合成，O和N脱烷基作用，以及药物的羟基化过程中都起到了很微妙的作用，其奥秘正在一步步地被揭示出来。表6 微生物细胞色素P450加单氧酶系一览表菌 名加单氧酶组分生理功能基 质细菌：Bacill
8、us megaterium可溶性的P450（CO抑制、NADPH、细菌铁氧还蛋白）脂肪酸的氧化软脂酸Bacillus megaterium(ATCC 13,368)可溶性的P450，巨大氧还蛋白（非均一铁硫蛋白），巨大氧还蛋白还原酶（黄素蛋白）甾体化合物的15b羟基化3氧D4甾体化合物Corynebaterium sp.(TElc)可溶性的P450，黄素蛋白还原酶，NADH正己烷氧化正己烷Nocardia(NIH菌株)P450（均一性纯化，分子量4200045000），NADH，黄素蛋白还原酶，氧还蛋白及其它分子量的蛋白质4O去烷基化4烷基苯甲酸盐Pseudomonas putidaPpG 7
9、86可溶性的P446（结晶，分子量4400046000），Putida氧还蛋白（铁硫蛋白，分子量12500），FAD-NADH-Putida氧还蛋白还原酶，分子量45000。莰酮5羟化酶莰酮Pseudomonas olcovorans可溶性的P450（CO，差光谱），NADH，红氧还蛋白，NADH红氧还蛋白酶脂肪酸和碳水化合物的氧化十二烷酸己烷Rhizobium bacteroids可溶性的P446（估计分子量为50000），无磷脂氮还原真菌：Acremonium sp.3EI微粒体的P450（意指由CO控制），NADPH烷烃氧化乙烷、丙烷、丁烷Claviceps purpurea微粒体的P4
10、50和P448麦角碱的生物合成含14C的色氨酸生物碱Cunninghamella bainieri(ATCC 1244)微粒体P450，NADPH，细胞色素C还原酶苯甲醚、氨基嘌呤、硝氨基苯甲醚、萘Cunninghamella elegans微粒体的P450，NADPH烃氧化作用萘Penicillinum patulam (CBS 384,48)微粒体的P450P455，NADPH，NADPH依存还原酶棒曲霉素的生物合成m甲苯酚Rhizopus nigricans (ATCC 62276)微粒体P45011a羟基化孕甾酮酵母菌：Saccharomyces cerevisiae微粒体P448，N
11、ADH细胞素b5还原酶，NADPH细胞色素C还原酶，脂类因子S. cerevisiae微粒子P447P448（估计分子量为51000），NADPH，细胞色素C还原酶S. cerevisiaeP450（意指由CO控制），NADPH甾醇代谢像酵母甾醇一样的羊毛甾醇4去甲基甾醇类S. cerevisiae JYD56微粒体P450，NADPH，黄素蛋白还原酶不饱和脂肪酸和麦角甾醇合成Schicosaccharomyces pombe 972h微粒体P450，其它细胞色素类Torulopsis sp.微粒体的P450（意指由CO控制），NADPH脂肪酸代谢油酸Candida tropicalisLM7
12、可溶性的P450，NADPH，NADPH细胞色素P450还原酶，溶血磷脂酰乙醇胺类脂氧化十二烷酸、氨基嘌呤、甲苯异丙基苄胺、己巴比妥、乙基吗啡C. tropicalis可溶性的P450，NADPH，NADPH细胞色素C还原酶烷烃，脂肪酸氧化十二烷酸、十六烷、氨基嘌呤、甲苯异丙基苄胺、己巴比妥、乙基吗啡C. tropicalis 1-01微粒体的P450，NADPH，NADPH细胞色素C还原酶四十烷和脂肪酸氧化C. tropicalis微粒体的P450，NADPH，NADH脂肪酸代谢联苯（4羟基化）三、细菌的细胞色素P450系统通常细菌的P450是可溶性的，需要NADH，具有一种黄素蛋白还原酶及
13、一种非均一的铁硫蛋白，呈现很狭窄的基质专一性，类似于甾体生源器官肾上腺线粒体的P450系统。细菌和哺乳类的细胞色素P450系统在其它方面也非常相似。Pseudomonas putida细胞色素P450（P450nm）同苯巴比妥诱导的肝微粒体比较，提供催化活性的竞争性结合和抑制作用，证明了免疫交叉反应。两种细胞色素P450具有相同分子量和氨基酸组成的亚单位。然而，微生物和哺乳类具有不同的基质专一性、可溶性、P450cam系统需要一种铁硫蛋白，而肝微粒体的P450cam系统需要磷脂。已经知道，细菌在电子传递链中所需要的其它成分同肝外细胞色素P450系统是相似的，酵母和真菌细胞色素P450系统非常类
14、似于在肝微粒体中发现的该系统。巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和PS.Putida是最规范的细菌细胞色素P450系统，可以把它们看作是典型的原核生物加单氧酶系。其它研究过的P450都来自于Pseudomonas oleovorans，Nocardia和Corynebacterium。PS.Putida的细胞色素P450cam从被莰酮诱导的微生物细胞中结晶出来。它是一种选择性的氧和基质*的莰酮次甲基5exo羟化酶的再活化组分。在基质存在的条件下，P450cam的纯化工作容易完成，该酶系统由两种不同的方法分离。结晶的细胞色素P450分子量是4400046000。这取决于测定的
15、方法。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳指出：蛋白质部分是由简单的多肽组成。加单氧酶系也包括假单胞氧还蛋白。这是一种分子量为12500的铁硫氧还蛋白，含有铁和由无机硫化物两个原子和一个FAD黄素蛋白，NADH假单胞氧还蛋白氧还还原酶。当黄素蛋白和铁硫蛋白供给还原剂时，细胞色素P450被结合和催化莰酮5次甲基的氧化。该铁硫蛋白也参加产物的形成。脸儿硫酸钠和CO处理过的P450cam在446nm处出现一最大的索瑞氏吸收谱。早些时候，Peterson等指出：P.Putida莰酮系统被甲吡酮所抑制。这种抑制剂对均一蛋白的结合作用同基质莰酮和由偶联的加单氧酶系摄取的氧所抑制的甲吡酮是竞争性的。已经指出，甲吡酮在肝微粒体P450中是一种典型的型基质。假单孢菌系具有同P450型基质相互作用的特征，当存在或缺少莰酮的条件下，发现加入甲吡酮到细胞色素P450，就出现差光谱。巨大芽孢杆菌P450行使脂肪酸氧化和甾体羟基化的功能。发现一种需要NADPH的无细胞甾体15b羟化酶系，并由一氧化碳、SKF525A、咪唑和甲吡
