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1、.基因工程制药姓名：惠霞学号： 2011506024班级： 2011级生技 1班专业资料.基因工程制药一基因工程制药常用的工具酶：基因工程的重要特点之是在体外实行DNA 分子的切割和重新连接。例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA 连接在起， 在很大程度上要依赖于某些工具酶。(一 ) 限制酶 (Restriction enzymes)限制酶即限制性核酸切酶的简称，是一类专一性很强的核酸切酶。与一般的DNA 水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。限制酶的种类型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不
2、大。型酶：相对分子质量较小，为20000 100000 ，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2 。能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。(二 ) DNA 聚合酶 (DNA polymerase)DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要 DNA 模板并且优先作用于DNA 模板，也可作用于RNA 模板，但效率较低。1 大肠杆菌DNA 聚合酶2. 大肠杆菌 DNA 聚合酶大片断 Klenow 片断3. T4 噬菌体 DNA 聚合酶4. 经修饰的 T7 噬菌体
3、 DNA 聚合酶（测序酶）5. TaqDNA 聚合酶及 AmpiTaqTMDNA聚合酶6. 反转录酶专业资料.（三） DNA 连接酶（ DNA ligase）：能将两段DNA 拼接起来的酶。1. T4 噬菌体 DNA 连接酶：催化DNA 的 5 羟基之间形成磷酸二酯键。2. 大肠杆菌 DNA 连接酶： 用途较窄，不常用。（四） 基因工程中常用的其他酶1. 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT 酶）2. T4 噬菌体多核苷酸酶3. 核酸酶（ Nuclease ）4. 碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphodiesterase）：能催化去除单链或双链DNA 和 RNA分子中的5磷酸基（
4、脱磷酸作用）。分为细菌碱性磷酸酯酶（BAP ），牛小肠碱性磷酸酯酶（ CIP）。二基因工程制药中常用的克隆载体载体：能在细胞进行自我复制的DNA 分子就是外源DNA 片段（基因） 的运载体（ Vector ）,又可称为分子载体或无性繁殖载体。基因工程制药中常用的目的基因克隆载体主要有：质粒、噬菌体、M13噬菌体和粘粒。（一）质粒1.质粒（ Plasmid ）是一些存在于微生物细胞染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位。2 常用的几种质粒载体（1 ）pBR322及其衍生载体pBR322最早构建成功的较理想载体，分子质量2.6 106u ， 4.36
5、kb ，属松弛型复制，含有两个抗性基因（Tetr 和 Ampr ），已确定32 个限制酶切割位点的相对位置。BamHI专业资料.等 10 个切点位于Tetr 基因， Pst I等 6 个切点位于Ampr基因组， EcoR I 位点位于这两个基因之间，有利于检出重组转化子。PAT153 载体：用限制酶 Hae 进行部分消化pBR322后再重新连接而获得，是不能被带动的较小质粒载体（3.66kb ），拷贝数比 pBR322 增加 1.5 3 倍。pBR327 载体：用 EcoR 部分酶切 pBR322 ，去除非必需区段（位点 14422502）后构建而成。长仅 3.27kb；没有泳动功能；质粒拷贝
6、数增加24 倍。(2) pUC 系列载体 pUC18 、 pUC19质粒载体含有 pBR322的 Ampr 基因、复制原 Ori 和 M13 噬菌体 M13mp 系列载体所用的LacZ 基因，在 Lac区有独特的限制酶识别位点组成的多聚接头顺序（即多克隆位点），这两个载体不同之处在于多克隆位点以互为相反的方向排列。pUC 质粒缺乏与控制拷贝数有关的mop 基因，故这些质粒复制的拷贝数要比带有pMB1(或 ColE1) 复制起点的质粒高的多。pUC18/19载体能表达LacZ 基因产物（半乳糖苷酶）的氨基端片段， 在相应的宿主 （ Lac- ）中可出现互补。 pUC118 、 pUC119 质粒
7、载体 pUC 的衍生质粒载体： pSP64 、pSP65 、pGEM-3Z 、pGEM-3Zf(-) 、pGEM-4 、pGEM-4Z等。（二）噬菌体1 常用的噬菌体载体（1 ） Charon 系列载体为克隆 DNA 大片段而设计的替换型载体。 代表性载体有： Charon4A 、pCharon21A( 早期 )、Charon3235 和 Charon40等。专业资料.（ 2 ） EMBL 系列载体克隆大片段基因组DNA 的替换型载体。 最常用的是 EMBL3 、EMBL4 和 EMBL3A ，这些载体多克隆位点上的BamH I 位点两侧分别有 EcoR I 和 Sal I 位点， EMBL3
8、和 EMBL3A 含有对称的两个多酶位点聚合接头序列（Sal I-BamH I-EcoR I ），以便于 Sal I 、 Xho I （都是TGGA ）、 BamH I 、 Mbo 、 Bgl、 Xho I ( 都是GATC) 和 EcoR I 等 7 种限制酶切点外源 DNA 片段的克隆。 EMBL4 的多聚接头区的限制性切酶位点顺序刚好与EMBL3 颠倒。（3 ）gt 系列载体插入型系列载体，包括 gt10、 p gt11和gt18 23 等系列载体。gt 载体是专门为在其免疫区（imm434）单一的 EcoR I 位点上克隆小的cDNA 片段（约6kb ）而设计的。 gt10 为 43.
9、3kb ，在它的阻遏基因 CI 中有唯一的 EcoR I位点，外源 cDNA片段（ 7.6kb ）插入此处时， 使 CI 基因失活， 形成了重组的CI 噬菌体， 噬菌斑为清亮斑，可与非重组的CI 噬菌斑所产生的阴暗噬菌斑相区别。gt11载体是一个常用的，可用于免疫学筛选的载体。具有可表达性，为43.7kb ，在它的LacZ 基因末端（位于终止密码上游53bp处），有唯一的EcoR I 位点，可用于插入外源DNA 片段。gt18 、gt19是gt 的衍生载体， 其 LacZ 的 EcoR I 位点插入了一个含Sal I 、 Sac I 、XbaI 和 EcoRI 位点的多克隆位点，但只有EcoR
10、I 和 Sal I 是单一酶切点，cDNA片段可插入LacZ 单一的 EcoR I 或 Sal I 位点。（三）M13噬菌体1 M13噬菌体的基本特性M13噬菌体的基因组为环状单链DNA 分子，由6407 个核苷酸组成，有8 个基因。 M13是雄性专一性的，即只吸附于带有F 质粒的雄性大肠杆菌（F）的性纤毛上而引起感染的。专业资料.受 M13 感染的细胞不被裂解破坏，在平板上不形成空斑而是形成缓慢生长的慢性感染细胞圈。2 常用的 M13噬菌体载体M13mp18和 M13mp19，这两个载体在LacZ 区的多克隆位点中都含有13 个不同的酶切位点（只是在多克隆位点的方向上有所不同），可供插入由多
11、种各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段。（四）粘粒（ Cosmid ）1 粘粒：是一种有噬菌体粘性末端的杂种质粒，由DNAcos区与质粒DNA重组构建而成。它是为克隆和增殖基因组DNA 的大区段而设计的，是组建真核生物基因文库及从多种生物中分离基因的有效手段。粘粒大小一般为47kb 。最简单的粘粒是一些经过改造的质粒，它们带有一个拷贝的cosDNA序列（将DNA包装的噬菌体颗粒中所必需的序列），携有一个复制起点（通常是ColE1 复制起点）和一个抗药性标记（通常是Ampr ）（五）哺乳动物细胞载体系统（用于转染哺乳动物细胞的载体，有两类）不带真核复制子的质粒型载体：在原核质粒中插入一个完整的哺乳动物细胞转录单位和一个选择标记基因而组成的简单载体系统。这类载体在转染哺乳动物培养细胞之前要在细菌中进行扩增， 而在转染后则整合到细胞基因组中并在基因组调控下低水平地表达相应的蛋白质。如pTK2 、 pHyg和 pRSVneo等。带有真核病毒调控序列元件的质粒表达载体。如：SV40 载体、牛乳头瘤病毒（BPV ）载体和人类疱疹病毒（EBV）载体。三连接方法1 、粘性末端DNA 片段的连接 :专业资料.DNA 分子的体外连接 （重组） 是指外源 DNA片段和载体 DNA 分子在体外通过DNA连接酶共价连接。 具有粘性末端DNA 片段的连接比较
