《60Coγ射线照射对肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞的生物效应》由会员分享，可在线阅读，更多相关《60Coγ射线照射对肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞的生物效应（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、60Co射线照射对肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞的生物效应 作者：刁瑞英, 宋良文, 王少霞, 李明【摘要】 目的: 探讨60Co射线照射对肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞的生物效应。方法: 原代分离肺内II型上皮细胞(AT)和间质细胞包括巨噬细胞和成纤维细胞, 分别进行0、 3、 5、 7 Gy的射线照射, 用细胞核嗜银染色观察照射对AT增殖的影响; 用酶谱分析检测照射后AT和间质细胞培养上清中基质金属蛋白酶2、 9的活性; 用ELISA检测间质细胞培养上清中TGF1和IV型胶原含量。结果: AT的核仁数量随照射剂量增加而增多, 其中7 Gy组最高; ATII培养上清中MMP2、 9活性随照射
2、剂量增加呈先增高后降低趋势, 间质细胞上清中MMP2、 9活性和TGF1水平逐渐升高, IV型胶原分泌水平呈先降低后升高趋势。结论: 放射性肺损伤早期, AT、 巨噬细胞和成纤维细胞均参与肺组织无效性重建过程, 与晚期肺纤维化启动有一定的内在联系。【关键词】 肺泡II型上皮细胞 间质细胞 MMPs TGF 1 IV型胶原Abstract AIM: To explore the biological effect of 60Co ray on alveolar type cells and interstitial cells of alveoliar septum. METHODS: Alve
3、olar type cellsand interstitial cells including interstitial macrophages and fibroblasts were irradiated by 0, 3, 5, 7 Gy of ray respectively. The effect of irradiation on AT proliferation was observed by argentation against nucleus. The activity of MMP2, 9 in supernatants from AT and interstitial c
4、ells after irradiation was determined by zymography. The levels of TGF1 and collagen type IV in supernatant from interstitial cells after irradiation were measured by ELISA. RESULTS: The nucleolus number of AT was increased with the increase of irradiation dose and group 7 Gy reached the highest lev
5、el. The activity of MMP2, 9 in supernatant from AT after irradiation increased at first and then decreased gradually. The activity of MMP2, 9 and the content of TGF1 in interstitial cells increased step by step, but collagen type IV decreased at first and then increased. CONCLUSION: AT, macrophages
6、and fibroblasts are all involved in pulmonary invalid remodeling course in early radiation pulmonary injury, which is related to the initiation of pulmonary fibrosis in late period.Keywordsalveolar type cell; interstitial cell; MMPs; TGF1; collagen type IV放射性肺损伤和肺纤维化为临床常见并发症, 其发生机制尚未完全明了, 因此有效防治较为困难
7、1。肺损伤早期的形态学改变主要是肺泡基底膜型胶原降解, 继发引起成纤维细胞增生及型胶原再度增多, 常导致肺重建发生。基质中IV型胶原合成和降解平衡失调可能与晚期肺纤维化的启动有关。基质金属蛋白酶2和9(Matrix metalloproteinase2, 9, MMP2, 9)是IV型胶原特异性降解酶。多种细胞参与了肺损伤重建过程, 其中肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞在肺损伤重建和纤维化发生中起重要作用。本研究拟原代分离上述细胞, 探讨60Co射线对肺内细胞的生物学效应以及在早期肺损伤重建中的作用, 揭示放射性肺损伤与肺纤维化之间的内在联系。1 材料和方法材料 Wistar大鼠由军事医学科学院
8、动物中心提供; 新生小牛血清购于杭州四季青生物工程研究所; RPMI1640培养基、 DNase、 大鼠IgG、 Triton X100购于Sigma公司; 小鼠抗人型胶原单克隆抗体(mAb)购于北京中杉金桥生物科技有限公司; 兔抗大鼠TGF1多克隆抗体购于博士德公司。方法AT和间质细胞原代分离 参照Dobbs等的方法,g/L胰蛋白酶消化和剪碎肺组织, 将细胞悬液加入大鼠IgG包被的培养瓶, 37孵育3 h, 贴壁细胞为巨噬细胞和Fb混合体, 将漂浮细胞离心8 min获得AT。锇酸染色鉴定AT。细胞处理 将接种AT的培养瓶随机分为 0、 3、 5、 7 Gy4 组, 每组3瓶, 分别进行射线照
9、射, 继续培养48 h后收集上清, 4 3000 r/min离心10 min, 同时制备细胞爬片。间质细胞的处理同上。照射后AT的增殖分析 爬片入水, 将染液滴于其上1 h, 封片后图像分析, 在400倍下每组取10个视野, 测定每个视野的颗粒个数及颗粒面积, 求出平均吸光度值。培养上清MMP2、 9活性检测 参照文献, 将AT和间质细胞上清进行SDSPAGE电泳、 洗脱、 漂洗、 孵育、 染色及脱色, 成像分析条带面积和灰度; MMP2、 9活性条带面积。间质细胞上清TGF1和IV型胶原测定 (1)TGF1: 上清倍比稀释, 双平行孔, 37 2 h, BSA 37封闭2 h, TGF1多克
10、隆抗体 (150) 37 30 min, HRP标记的羊抗兔IgG (110000) 37 30 min, TMB 37显色15 min, 2 mmol/L硫酸终止反应; 在450 nm处检测吸光度A值; (2)IV型胶原: 同上, 一抗为小鼠抗型胶原mAb, 二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgG。统计学处理 应用统计软件进行数据处理, 平均吸光度A值以xs表示, 组间差异比较采用t检验。2 结果AT分离和鉴定 每只大鼠可分离2107 AT, 锇酸染色显示胞质内含有嗜锇板层小体, 细胞纯度85%。照射对AT增殖的影响 照射后AT内核仁增多, 其中3、 5及7 Gy组的平均A值较0 Gy组分别增加了
11、%、 % 及%, 7 Gy组核仁增多最明显。图1 照射后AT核仁的相对含量Fig 1 Nucleolus number of AT after irradiation (Argentation),vs 0 Gy group.细胞上清MMP2、 9活性 (1)在AT上清中, 3和5 Gy组MMP2活性较0 Gy组分别增加%、 %, 7 Gy组较0 Gy组降低%; 3、 5及7 Gy组MMP9活性较0 Gy组分别增加%、 %和% 。 (2)在间质细胞上清中, 3、 5和7 Gy组MMP2活性较0 Gy组分别增加%、 %和%; MMP9活性较0 Gy组分别增加%、 %及%。图2 照后AT和间质细胞上
12、清MMP2、 9活性(图像分析)Fig 2 Activities of MMP2, 9 in supernatant from AT(A) and interstitial cells(B) after irraidiation,vs 0 Gy group.间质细胞上清TGF1含量 照射后上清中TGF1含量出现不同程度的增高, 其中3、 5及7 Gy组较0 Gy组分别增高2%、 %及%, 5和7 Gy组均具有统计学意义 (图3)。图3 间质细胞上清TGF1含量Fig 3 The level of TGF1 in supernatant from interstitial cells,vs 0
13、Gy group.间质细胞上清IV型胶原含量 上清中IV型胶原含量随照射剂量增加呈先降低后增高趋势, 其中3和5 Gy组较0 Gy组分别降低%和%(), 而7 Gy组较0和5 Gy组增加了%()和100% (), 均具有统计学意义(图4)。图4 间质细胞上清IV型胶原含量变化Fig 4 The level of collagen type IV in supernatant from interstitial cells,vs 0 Gy group.3 讨论 肺内AM和Fb胞膜表面含有IgG的Fc段受体, 能与IgG的Fc段结合, 而AT表面则缺乏Fc段受体。根据这一原理, 本实验采用免疫黏附
14、选择法, 将原代肺组织细胞悬液培养于被覆IgG的平皿中, 有Fc段受体的AM和Fb被黏附贴壁, 而无Fc段受体的AT得以分离, 可分别获得II型细胞和肺泡壁间质细胞用于放射性肺损伤机制探索。AT作为肺泡壁重要的结构细胞,能修复受损的肺泡I型上皮, 合成基底膜物质和IV型胶原。AT向肺泡I型上皮的转化过程是由TGF 1通过Smad信号转导途径介导的。AT的增殖与凋亡在急性肺损伤和放射性肺纤维化的发生中至关重要。有实验表明, 在博来霉素致肺纤维化早期, AT中MMP2基因转录明显上调。ATII还可产生MMP9, 后者与MMP2共同参与受损肺组织重建过程。ATII在放射性肺损伤中对照射的反应尚不完全
15、清楚, 本实验通过细胞核嗜银蛋白染色分析发现, AT的核仁随照射剂量增加而增多, 这与对大鼠单侧胸部照射致肺纤维化模型的病理变化相一致, 表明射线照射能促进肺泡ATII异常增殖。明胶酶谱分析发现, 小剂量射线照射后, ATII中MMP2、 9的酶活性明显增高, 但随照射剂量增加呈逐渐下降趋势, 甚至低于正常对照水平。提示一定范围剂量的照射能促进ATII异常增生和MMPs的合成, 但剂量偏高时抑制MMP2和MMP9的合成与释放, 影响对肺泡隔过多IV型胶原的降解作用, 易于启动肺组织重建的发生。目前关于IV型胶原降解对肺纤维化发生的作用仍有争议。有研究认为, 明胶酶降解基底膜IV型胶原容易使AT与肺泡隔Fb直接接触, 产生细胞间的某种信号转导, 可促进AT和Fb进一步活化和增殖10。有研究报道, Fb产生的HGF和角质细胞生长因子是AT最有效的有丝分裂原11。提示AT与Fb之间的信息交流在肺纤维化启动中可能具有一定作用。 TGF1可通过调控Fb的细胞周期促进其增殖, 参与放射性肺损伤的发生发展, 该效
