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1、真菌学实验报告一. 实验目的：1.1了解真菌形态的基本特征。1.2掌握丝状真菌制片方法。1.3掌握内生真菌的分离方法1.4掌握真菌的鉴定方法。二。前言：真菌广泛分布于地球表面,从高山、湖泊到田野、森林,从 海洋、高空到赤道、两极，到处都有真菌。真菌虽然不在空气中生长 繁殖，但它的孢子却成群的漂浮在天空，只要稍微注意你会发现人类 原来生活在真菌的汪洋大海中。当今世界,生物技术已迈入世界经济的支柱产业,真菌学在 生物技术的大潮中得到了长足的发展。真菌是原始的真核生物，具有 广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到比 动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的分 析
2、。因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具,真 菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供了 一个广阔的天地.植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性 ,植物物 种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富:抗病原性能越强 的植物,其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大 ;其所含的 内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性 物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎,根,花,种子或果实内生真菌的代谢产 物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用.研 究和开发内生真菌的寻找新的抗菌
3、活性物质具有广泛的应用前景。三. 材料与方法：3。1.1 材料：在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、根、花、种子或果实。3。1。2.药品与试剂：葡萄糖、蛋白胨、KH2P043H2O、MgS04 7H20，马铃 薯、琼脂。孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏， 蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。消毒剂：75的乙醇， 0.1%升汞（HgC打），次氯酸钠溶液（含活性氯10%） , 30%双氧水.双蒸2水、琼脂糖,Tris饱和酚、巯基乙醇（B - Mercaptoethanol）,石英 砂，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠， 盐酸，氢氧化钠,ED
4、TA,CTAB.3。1.3。培养基：3。1.3。1马铃薯、葡萄糖琼脂培养基马铃薯汁1000ml，葡萄糖20g,琼脂20g（注：取去皮马铃薯200克,切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升,加葡萄 糖20克,琼脂15克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟3.1.3。2 察氏琼脂培养基蔗糖 30g，NaNO 3g，MgSO。7H 0 0.5g, KCl 0.5g, FeSO .7H O342420。01g,KHPO 1g，琼脂 13g,蒸馏水 1000ml，自然 pH243。1.3。3 沙氏培养基蛋白胨1g,葡萄糖或麦芽糖4 g,琼脂1。5克，水100ml.制法
5、:1将上述物质称好，放入水中煮沸溶解（不必调PH即 有5左右）分中号试管（约4毫升）包扎，高压115C20分钟。趁热斜 好，凝固备用。3.1.3.4 马丁氏培养基葡萄糖 10g，蛋白胨 5g, KHPO 1g, MgSO 7HO0.5g, 1%2 4 4 2孟加拉红3。3mL，琼脂20g, 水1000mL, pH值自然。抗生素用法与用量：培养基灭菌之后分装前按链霉素40U/mL，青霉素30U/mL用量加入，冷却到45C左右未凝固时加入抗 生素,混匀倒平板.四。方法：4。1。1采样方法:在校园内找到银杏、喜树、桂花树并用刀采集叶、茎、 根、皮、种子.4。1。2样品前处理:分别取根、茎、叶、果实,
6、用洗涤剂在自来水下洗净. 老树皮用75%酒精进行表面消毒后,用镊子取出，于 酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1X1cm2大小置于PDA固体培养 基上.对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒：75%的酒精漂（浸）洗23min无菌水冲洗4-6次一0。1%升汞不同 的消毒时间（见表22，共设置7个梯度）一无菌水冲洗46次一 用灭菌滤纸吸干多余水分一无菌刀片将材料切成小块将根、茎的表 皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成05X0。5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间,倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶 液充分
7、接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前1-2 分钟,开 始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出,倾净后立 即倒入无菌水，轻搅漂洗.灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无 菌水时为止。灭菌液要充分浸没材料.宁可多用些灭菌液，切勿勉强 在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。4。1。3 内生菌的分离方法：将上述组织块置于分离培养基上（每一平皿培养5块组织块）于27C恒温培养，同时将上述消毒过程中最后一次冲洗 组织块后的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。 观察菌丝生长情况及污染情况。4。1。4 纯化方法： 培养34天后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形 态不同的菌丝或菌落移
8、种到新鲜PDA培养基上.纯化3-4次以保证所 得菌落为纯培养。4.2 形态鉴定方法：4.2.1 培养方法:4.2.1。1培养基：查氏培养基、沙氏培养基和PDA培养基。4。2.1.2将4C保存菌种活化2次；4.2。1。3将活化菌种分别点种PDA、沙氏、察氏平板，每重复4.2。1。425C恒温培养箱培养7天；4.2.1。5然后进行菌落特征描述，取一个平行进行制片（胶带子粘片法），观察个体形态；4。2.1.6 另两个平行继续培养至14 天，取出;4。2.1。7 重复步骤4,作为最终描述结果；4。2.1.8 根据真菌分类鉴定手册和相关资料分析确该菌的归 属。4。2。2 制片方法：胶带粘贴法：选用在显微
9、镜油镜下观察细致不粗糙且粘性好的 胶带。取一小段胶带从菌落表面的中心向边缘粘，75乙醇固定，乳 酸石炭酸棉蓝染色液染色,将粘有菌丝的一面向上,盖上盖玻片，于显 微镜下观察产孢结构等特征。4.2.3 鉴定标准：4。2。4 菌落宏观形态：大小：以菌落的直径（mm）表示。颜色:包括菌落表面和背面的颜色，及色素是否渗入培养基。 菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或 疏松等.菌落的质地:毡状、毯状、绒毛状、棉絮状、粉粒状、革质状、 有无成束状或绳状的气生菌丝。菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分状况等. 菌落边缘：全缘、锯齿状、树枝状等。渗出物：菌落表面有无液滴及液滴的颜色等
10、。4。2.5 个体形态：菌丝的特征：表面性状（粗糙或光滑），宽度等分生孢子梗：分支情况简单或复杂，轮生或单生等；长短； 基部粗糙或光滑等。 产孢结构的形态特征：形状，大小，着生状况（位置，单生、互 生或成轮生体）分生孢子的形态：形状，大小，表面状况,聚集方式（直链、斜 链或聚集成头）4.3 分子生物学鉴定:4。3.1 培养方法:培养基成分与不加琼脂的PDA固体培养基成分相同。将液体 培养基以100mL每瓶分装至250mL三角瓶中，用8层纱布封口。121C, 蒸汽灭菌 20min。将菌丝致密的真菌接种到液体培养基中,于恒温振荡培养箱中 27C、120rpm 培养 57 天。用两层灭菌纱布过滤菌丝
11、球,用无菌蒸馏水冲洗菌丝球 5次，避免培养基中的糖类和蛋白对DNA提取的影响。40C下烘干菌丝，但是不 要过于干燥，然后进行DNA的提取。4.3.2基因组DNA的提取DNA 提取采用 CTAB 法。 CTAB（ cetyltriethylammonium bromide，十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜， 它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的，当降低溶液盐浓度 到一定程度时，从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与核酸的复合物 同蛋白质、多糖类物质分开,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于 高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。CTAB法的好 处是能很好地去掉
12、糖类杂质，提取前期可得到高含量的DNA。4。3. 2。1用CTAB法提取材料DNA的具体步骤如下：将CTAB buffer在65C水浴锅中预热，研钵用液氮预冷；4。3.2。2取0lg左右菌丝体，在液氮中迅速研磨成粉末后,迅速加 入5mL预热的提取液及10ULB-巯基乙醇，混合均匀后把混合液转 入1.5mL离心管中700 UL/管；4。3。2.3于65C水浴保温0.5Th，时间不能超过1.5h。保温期间 要轻轻振摇几次；4。3.2.4冷却至室温后，加入等体积（700 UL）的饱和酚：氯仿：异 戊醇（25:24:1）,充分混匀后静置10min。4.3.2。5离心（12000rpm，10min,室温
13、），去沉淀，将上清液转入干 净离心管中.4。3。2。6 根据杂质的去除情况重复步骤4、5数次,直至无杂质； 4。3.2。7加入等体积氯仿:异戊醇（24：1）抽提一次以去除饱和酚， 离心（12000rpm，10min,室温）；4。3。2.8将上清液逐滴加入两倍体积的一20C预冷无水乙醇，以沉 淀出DNA。室温放置10-20min，可以过夜；4.3。2。9挑取或离心去上清液（10000 rpm，5min）的方法取出DNA； 用75%乙醇洗涤两次；仃0 37C保温箱中干燥后溶于适量的TE缓冲液中4C备用.4。4 所用引物ITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGITS4：TCCTCCGC
14、TTATTGATATGC4. 41PCR反应条件:4.4。1。1体系：PCR反应体系为50uL体系，包括:10XPCR buffer：1/10MgCl2 ：1.5mM,dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP):各 200 uM,Primer10。2uM,Primer20。2uM,Taq 酶：12.5U，DNA模板：约 100ng。4。4.2条件：扩增条件预变性95C5min变性95C1min复性51C1min3035个循环延伸72C1min延伸补齐72C10min4。4.3测序方法：送测序公司。4。4.4序例分析:五结果及分析：纟吉果：试验分离到两种真菌5。1八爪金盘分离到菌种查氏
15、正反照5.1.1菌落宏观形态：大小：菌落的直径3.2(mm)。颜色：包括菌落表面棕黑色背面灰色,色素渗入培养基菌落表面的纹饰:如皱纹、整个菌落致密。菌落的质地：毡状菌落的高度：凸起或隆起。菌落边缘:锯齿状。渗出物：菌落表面无液滴。5.1.2个体形态：菌丝的特征:表面粗糙.分生孢子梗：分支复杂，轮生。5。1。3 分子生物学鉴定通过PCR扩增和序列分析，送公司检测得到的序列为：TGAAGTTAAAAAGCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACAAGTGACCCCGGTCTAACCACCGGGATGTTCATAACCCTTTGTTGTCCGACTCTGTTGCCTCCGGGGC
