器官保存液解读

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1、摘要 基于器官保存的方法在当下医学中研究的一个热点，主要用摘要 针对其水溶性差的关键问题，合成表征了含铬、钼、钨羰基金属化合物。在充分考虑释放体系酸碱度、 温度和传输溶剂等因素的基础上， 采用肌红蛋白法，全面测定了铬、钼、钨羰基金属化合物的 CO 释放性能。结果发现，此类化合物能够在水相缓释 CO，具有较好的生物相容性。 红外表征与释放动力学 Boltzmann 拟合图谱结果表明， Mo 系列（ 2a-2e）卡宾化合物可作为快速的一氧化碳释放分子， Cr 系列（ 1a-1e）卡宾化合物具有适中的 CO 缓释性能，其释放速率平稳、有效。 W 系列化合物等的释放速率较慢，可适用于需要缓释 CO 的

2、生物体系。第六族羰基金属阴离子均具有较好的水溶解性和 CO 缓释性能。由于金属钼生物相容性好， Mo-CO 具有适中的稳定性，有可能响应生理释放诱导因子缓释，是一类极具医学应用前景的 CO-RM 。此类释放分子的 CO 释放效率很高，每个金属可携带五个 CO。水溶性离子化合物 Mo-Br 键具有适中的调节能力， 且含有五个羰基，而且 Mo 金属无毒，是一类优秀的释放分子。但是通过其释放动力学测试可知，其释放速率均较快。CORM 是近年来合成的一类含有过渡金属的新型撰基化合物f_ 液使用一种大分子量的阴离子( 如乳糖醛酸和三糖 ) 来抑制免疫诱导的细胞肿胀，内含胶质#羟乙,能可控制地释放CO 。

3、基淀粉 #腺苷和谷胱甘肽，还包括别嘌呤醇，ij; Hj浓度比有一定的比例f_液比其他保存液有更广阔的保存领域，如对心脏 #肺 #肝脏 #肾脏 #胰腺 #小肠的保存 这种保存液允许最长期的安全保存时间，并且显示对保存单个细胞也有效，包括 : 胰岛 #肝细胞 ! 4( 第二，在充分考虑释放体系酸碱度、温度和传输溶剂等因素的基础上，采用肌红蛋白法，全面测定了 15 种阴离子型卡宾化合物的 CO 释放性能。结果发现，此类阴离子型卡宾化合物能够在水相缓释 CO，具有较好的生物相容性。红外表征与释放动力学 Boltzmann 拟合图谱结果表明， Mo 系列（ 2a-2e）卡宾化合物可作为快速的一氧化碳释放

4、分子， Cr 系列（ 1a-1e）卡宾化合物具有适中的 CO 缓释性能，其释放速率平稳、有效。 W 系列化合物等的释放速率较慢，可适用于需要缓释 CO 的生物体系。肌红蛋白 (Myoglobin) 实验：用分光光度法通过测量脱氧肌红蛋白 (deoxy-Mb) 转化为羰基肌红蛋白 (Mb - CO) 的量来研究金属羰基化合物释放一氧化碳的能力。而 Mb-CO 的浓度是通过测量该蛋白的 Q 带(540nm)的吸光度来定量的。将肌红蛋白溶解在 pH 7.4 磷酸缓冲液（ PBS）中，用连二亚硫酸钠将其还原为脱氧肌红蛋白 (deoxy-Mb) ，定量并测试并得到其紫外光谱，然后用 CO 鼓泡，获得羰基

5、肌红蛋白 (Mb - CO)的紫外光谱。 CO-RMs 溶解在适当的溶剂中（ DMSO，乙醇），然后添加到试管中的脱氧肌红蛋白 (deoxy-Mb) 中，用吸液管混合并上置矿物油以防止 CO 外溢或者亚铁肌红蛋白被氧化。 Mb-CO 浓度对时间曲线应用SigmaPlot 的非线性回归程序进行处理，一氧化碳释放分子的半衰期可通过外推方程所得。本文释放分子合成从六羰基金属铬、钼、出发，经由 Fischer 卡宾反应，生成阴离子卡宾化合物。2.2 实验部分试剂与仪器六羰基铬，六羰基钼，六羰基钨（ GR，北京鸿睿天维科技有限责任公司） ，甲基锂（ 1.6M 乙醚溶液，阿拉丁试剂（上海）有限公司） ，四

6、甲基氯化铵，四乙基溴化铵，四丁基溴化铵，苄基三甲基溴化铵，苄基三乙基溴化铵（ AR ，阿拉丁试剂（上海）有限公司） ，二甲亚砜（ AR ，国药集团化学试剂有限公司） ，四氢呋喃（ AR ，国药集团化学试剂有限公司，除水除氧） 。恒温磁力搅拌器（ S25-2，上海司乐仪器有限公司），傅立叶变换红外光谱仪（ EQUINX55 ，德国 Brucher 公司），超导傅立叶数字化核磁共振谱仪（ Bruker 公司）。称取 1.1 g（5 mM ）六羰基铬加入 Schlenk 反应管中，采用真空线操作技术，用双头针在 N2 气保护下加入 8 mL 干燥 THF，机械搅拌，再用长针头逐滴滴加 3.1 mL

7、CH3Li 溶液（ 1.6 M），溶液由淡黄色逐渐加深直至深红色，在冰浴下反应 40min，即得第一步中间产物阴离子卡宾中间体。将阴离子卡宾中间体溶液转移至圆底烧瓶，加入50 mL 四丁基溴化铵（ 5 mM ，1.62 g）的水溶液，振荡，溶液颜色呈亮黄色，烧瓶底部有少量黄色固体形成。将混合溶液进行旋蒸， 液面上产生大量气泡， 黄色的溶液逐渐变澄清， 瓶壁上有雪花状黄色固体生成， 直至气泡不再产生时停止旋蒸。 抽滤，得淡黄色有金属光泽固体粉末五羰基乙酰基合铬（ 0）酸四丁铵(CO) 5CrC18H39ON 的合成五羰基乙酰基合铬（ 0）酸四丁铵合成方法同化合物1c。 淡黄色有金属光泽粉末五羰基

8、乙酰基合钼（ 0）酸四乙铵(CO) 5Mo=C(O)CH 3N(C 2H 5)4血红素氧合酶系统由亚铁血红素释放的CO 可能在不同的细胞 和生物学过程中作为一种调控分子，类似于 NO 。这两种物质引起平滑肌松弛，导致内皮组织血管舒张，这可能是CO 介导的抗 缺血再灌注损伤的细胞保护作用的机制。在灌注时 CO 通过抑制血管收缩维持微循环血流，减少 缺血再灌注损伤 相关的微血管 血栓形成。 血红素氧合酶系统 CO 在缺血再灌注损伤 中的细胞保护作用其他的机制可能还有： 抑制诱生型一氧化氮合酶（ iNOS ），抑制内皮细胞凋亡。辅以 HO-1竞争性抑制物锌原卟啉发现外源性CO 能完全取代内源 性 H

9、O-1抑制肝脏缺血再灌注损伤 。因此， HO-1介导的细胞保护抗缺血再灌注损伤需要外源 性 CO 的产生，并且完全能够被 CO 替代。 国内杨定华等分别应用HO-1诱导剂（ CoPP ）、抑制剂（ ZnPP ）和 生理盐水作为对照在供肝收获前处理供者，移植后3d观察肝脏移植物缺血再灌注损伤情况，以上证实了 HO-1表达上调对肝脏的 缺血再灌注损伤 的保护作用，证实HO-1 表达上调时，肝脏移植物内肝细胞损伤减轻，HO-1 表达抑制时，肝细胞损伤加重。杨定华 张华等 HO-1的表达对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用，通过经典的 Fischer 卡宾制备方法，合成了 15 种阴离子卡宾化合物，并通过

10、FT-IR、 NMR 和 ESI-MS 等多种鉴定手段对产物结构进行了表征，结果与预期结构一致。采用肌红蛋白法，综合释放体系 pH 和传输溶剂等因素，全面评价了这 15 种化合物的 CO 释放性能，结果发现，此类阴离子卡宾化合物在水相可溶，表现出良好的 CO 缓释性能。随着 pH 增大，释放速率依次减小； Cr 羰基物具有适中的 CO 释放速率， Mo 羰基物的释放速率最快，而 W 羰基物最慢。 CO 释放分子法测定 CO 与肌红蛋白（ Mb ）的结合平衡常数表明，这类化合物在生物医学领域具有很大发展潜力。肌红蛋白 (Myoglobin) 实验：用分光光度法通过测量脱氧肌红蛋白(deoxy-M

11、b)转化为羰基肌红蛋白 (Mb - CO) 的量来研究金属羰基化合物释放一氧化碳的能力。而Mb-CO的浓度是通过测量该蛋白的Q 带(540nm)的吸光度来定量的。将肌红蛋白溶解在pH 7.4 磷酸缓冲液（PBS）中，用连二亚硫酸钠将其还原为脱氧肌红蛋白 (deoxy-Mb) ，定量并测试并得到其紫外光谱，然后用CO 鼓泡，获得羰基肌红蛋白 (Mb - CO)的紫外光谱。 CO-RMs 溶解在适当的溶剂中（ DMSO，乙醇），然后添加到试管中的脱氧肌红蛋白 (deoxy-Mb) 中，用吸液管混合并上置矿物油以防止 CO 外溢或者亚铁肌红蛋白被氧化。 Mb-CO 浓度对时间曲线应用SigmaPlo

12、t 的非线性回归程序进行处理，一氧化碳释放分子的半衰期可通过外推方程所得。用 CO 设备监测 CO 在缓冲液中释放具体实验步骤及数据处理如下：三口瓶分别装备一氧化碳气体检测器和双排管真空线，用翻口橡胶塞(Suba-seal)密封其余两个瓶口。使用针管向PBS 溶液加入释放分子的水溶液或DMSO溶液。当体系内气液平衡后，控制体系的压力等于1atm，释放的CO (Nco)可有下列公式计算：NCO =+ cVl = p ( + )P 为 CO 的分压， Vg 和 V1 为气相体积 (排水法测定 )和溶液体积， R 是气体常数， T 为温度， c 代表 CO 在 PBS 的溶解度， k 是 CO 在水

13、中的 Henry 定律常数 (1052.63 (L atm)/mol at 25C) 。早期的释放分子如Fe(CO) 5、Mn 2(CO) 10 等化学性质比较稳定，需要通过光解才能释放CO 。 随后研究发现， 所有的过渡金属 CO-RMs都具有光敏性。具有光敏性的过渡金属羰基化合物通常除了在光诱导下降解释放CO ，不响应其他各类环境释放诱导因子， 因此这类羰基物被称为光敏性一氧化碳释放分子 (photo-CORM) 。Mn 2(CO) 10，是光解下产生CO 的典型金属羰基物当反应发生时， 破坏 Mn-Mn 键，释放 CO ，生成 Mn(CO) ，29CO 更易在短波 308和 266 nm 处发生解离 65。但由于其结构过于稳定且不溶于水，因此并非光解类CO-RMs 的理想选择。而 Fe(CO) 5虽能光解产生 CO ，但由于其高毒性使得应用受到限制。Niese 研究小组将 RC (pyrazolyl)Mn(CO) PF， R336=H 溶于 DMSO ，利用肌红蛋白法检测其在波长为365 nm处的光解，发现 RC (pyrazolyl)Mn(CO)PF，R=H 可336释放 2 个 CO 。 Pfeiffer 小组在此基础上用多肽类物质取代R 基，发现可以增加其水溶性和可能的生物学靶点89。