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1、 . . . 桑黄菌丝液体培养与多糖提取工艺优化研究报告第一篇 桑黄菌丝培养与多糖提取工艺优化第1章 绪论1.1 前言桑黄是目前国际公认的抗肿瘤效果最好的大型真菌之一，巴西蘑菇即姬松茸与其疗效相近。由于用于一般化学疗法的抗癌剂的毒性强，对癌症患者正常体细胞也具有杀伤作用，而桑黄多糖则几乎没有毒性，其通过提高机体免疫能力，杀伤癌细胞，这是真菌多糖抗癌的一大优点。桑黄多糖能明显提高患者的免疫能力，当与一般的抗癌化学疗法并行使用时，可以进一步提高治疗效果。因此桑黄的研究以与开发利用越来越热1。桑黄最早在日本与国得到开发利用，现已开始小批量人工栽培。由于天然的桑黄数量非常稀少，难以成为稳定的工业产品来
2、源，国一制药公司已率先开发出桑黄菌丝体培养法新技术，人工生产桑黄活性物质，并将其提取物用冻干法加工成粉末。由于抗癌效果显著，桑黄提取物干粉在国市场的售价高达每克2000多美元。日本一家专门从事生药加工的医药企业“津村株式会社”将人工培植的桑黄子实体加工成“破壁细胞超微粉末”，生产的“桑黄”(超微)粉末胶囊每瓶(288粒)售价高达3万日元。据统计，仅日、两国市场2002年各种桑黄剂的销售额合计已逾100亿日元。美国在本世纪初开始从日本进口桑黄制剂作为膳食补充剂在本土销售。我国省市凭借独有的地域优势，现已开发出复合桑黄口服液，主要销往日本与国，在当地也有一定的消费市场。根据目前所掌握的资料，由于外
3、商需求量大，价格高，致使国各产地进行掠夺性开采，子实体孢子无法大量形成。结果造成该资源在东北地区已经难觅踪影，西北也即将枯竭。再加上我国天然的桑黄数量本来就非常稀少，子实体的人工栽培尚处于起步阶段，所以要想形成稳定的医药工业产品来源，就必须充分挖掘桑黄的自然资源，深入开展桑黄的人工栽培；另外还要进行菌种的分离培养，利用现代生物技术进行深层发酵。同时，应进一步测定桑黄提取物中的有效成分，探索其与菌种、菌龄以与培养条件的关系，确定桑黄有效成分在提高人体免疫机能、疾病的预防和治疗等方面的作用机制，使桑黄能够早日应用于人类的医疗保健事业2。1.2 简介桑黄1.2.1桑黄的名称与分类桑黄（Phellin
4、us igniarius、Phellinus linteus和Phellinusbaumi）别名：火木层孔菌、针裂蹄（裂蹄）和鲍氏层孔菌。桑黄菌是一种多年生珍稀药用真菌，属担子菌纲(Basidiomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceae)，木层孔菌属(Phellinus)3。桑黄子实体中等至较大，无柄。菌盖半球形，剖面扁平至马蹄形，深烟色至黑色，有同心纹和环棱，初期有微细绒毛，后变光滑、稍龟裂，硬而木质化，212cm321cm，厚1.510cm，边缘锐或钝，其下侧无子实层。菌肉深咖啡色、锈褐色或浅咖啡色，厚27mm。桑黄生于、柳、桦、桃等阔叶树的
5、枯立木与立木上与树干上4。固因其着生树种不同，分为桑树桑黄、树桑黄和桦树桑黄等品种。其中，桑树桑黄子实体入药最佳。1.2.2桑黄的分布桑黄主要分布于中国、日本、菲律宾、澳大利亚、北美、中南美等地。在国，桑黄分布于、等地，即集中分布区在省东部乌里江与兴凯湖之间，西北地区与交界的“子午岭”自然保护区，国外主要在日本、国、俄罗斯等国家分布。1.3 桑黄的研究进展1.3.1桑黄药用功能的研究进展（1）抗肿瘤作用桑黄的抗癌功能最早被日本学者等发现，研究表明桑黄野生子实体的提取物对小鼠肉瘤180的抑制率为96.7%。研究还表明具有抗癌作用的物质是桑黄子实体中的多糖。（2）提高免疫力Hwan-Mook KI
6、M等用P.linteus的菌丝体胞外多糖（EPS）进行免疫学实验，发现EPS不仅能够使T细胞增殖，而且对不同同类抗原的T细胞也有增殖作用，并且毒性T淋巴细胞的毒性在加桑黄胞外多糖（EPS）后大大增强。Yun-HeeShon等发现桑黄提取物可以诱导相解毒酶包括苯醌氧化还原酶（QR）和谷胱甘肽-S转移酶（GST）的活性，并且提高了谷胱甘肽的水平。万国5等对桑黄子实体提取物对人外周血单个核细胞（PMNCs）产生C-干扰素（IFN-C）的研究表明桑黄具有诱生IFN-C的能力，能显著增高小鼠的血清IFN-C水平，有利于其发挥调节机体免疫力，抑制肿瘤细胞增殖的作用。（3）抗突变作用Shon6等用桑黄提取物
7、的抗突变实验中发现，提取物可有效的抑制诱变剂对沙门氏菌的诱变作用。 （4）抗血管生成试验Yun-SeonSong等在小鸡胚胎绒膜尿囊膜（CAM）试验中，发现随桑黄提取物加量的增加抑制效果增加，说明提取物有较好的抗血管生成活性。（5）清除自由基的功能Yun-SeonSong等在清除自由基1-(2，6-二甲基苯氧基)-2-(3，4-二甲氧基苯乙氨基)丙烷盐酸盐(DDPH)的试验和体外抑制脂类过氧化反应的试验中，发现提取物有较好的清除自由基DDPH活性。（6）抑制黄嘌呤氧化酶活性（治疗痛风）Yun-SeonSong等在黄嘌呤氧化酶抑制试验中，发现提取物能够完全抑制尿酸（尿酸盐微结晶沉积于关节而引起局
8、部粒细胞浸润与炎症反应的生成），有效的抑制黄嘌呤氧化酶的活性。（7）肝纤维化抑制作用万国等发现桑黄子实体提取物能显著降低血浆粘度和红细胞聚集指数，并且能提高肝损伤大鼠的蛋白质合成能力，显著降低血清氨基酸转移酶水平和胶原成分含量，使桑黄组肝细胞变性减轻，肝纤维增生减少。（8）抗脂质过氧化作用用CCl4诱导大鼠肝纤维化过程中，脂质过氧化是其主要的肝损伤机制。模型组大鼠血清活性氧显著升高，肝组织脂质过氧化产物MDA大量生成SOD活性受到明显抑制。桑黄虽然不能明显减少MDA的生成，但可以一定程度提高SOD活性，并且使血清中活性氧明显降低，表现出较好的清除氧自由基作用。（9）降血糖作用Kim7等用桑黄多
9、糖喂用链脲霉素导致的糖尿病大鼠，结果显示：桑黄多糖能够降低血糖，同时减少总胆固醇、三酰甘油和天冬氨酸转氨酶。这个结果让我们相信桑黄多糖在治疗人类糖尿病上将有所作为。（10）抗肺炎作用Beon-Su Jang8等用桑黄提取物预处理大鼠的实验中，发现桑黄提取物能够抑制肺炎大鼠炎症细胞包括嗜中性粒细胞的数量与白介素(IL)-1的水平。这个结果表明：桑黄提取物在抑制人类急性肺炎方面可能会有很大的作用。1.3.2桑黄化学成分的研究进展研究发现桑黄的菌丝体多糖和胞外多糖的分子量与分子结构是不同的。（1）子实体中的化学成分有资料报道P.1igniarius的菌体含落叶松蕈酸(菌丝体不含该成分)、藜芦碱、蘑菇
10、酸、间位二甲氧苯二甲酸等脂肪酸、麦角甾醇、过氧化物酶、氨基酸等成分，还有报道说P.1igniarius中木质纤维素的生物转化。莫顺燕等首次从P.1igniarius中分离得到5个黄酮和2个香豆素类化合物，分别为柚皮素(4，5，7-三羟基二氢黄酮)、樱花亭(4，5-二羟基-7-甲氧基二氢黄酮)、二氢莰非素(4，5，7-三羟基二氢黄酮醇)、7-甲氧基二氢莰非素(4，5-二羟基-7-甲氧基二氢黄酮醇)、北美圣草素(3，4，5，7-四羟基二氢黄酮醇)、香豆素(苯并吡喃-2-酮)与莨菪亭(7-羟基-6-甲氧基苯并吡喃-2-酮)；后来又分离得到两个新的二氢黄酮衍生物，分别为5，7，4-三羟基-6-邻羟苄基
11、二氢黄酮和5，7，4-2三羟基-8-邻羟苄基二氢黄酮。Gi-Young Kim等在桑黄子实体过DEAE纤维素阴离子交换和凝胶层析提取得到一种酸性蛋白多糖，在琼脂糖凝胶CL-4B层析色谱分析中可以测得该多糖分子量在150kDa左右。其氨基酸种类主要有天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸。用高压气相色谱仪测得该蛋白杂多糖中的糖链主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、树胶醛醣和木糖组成，其中碳链主链为己糖，戊糖为小部分构成侧链。用红外吸收光谱分析其官能团，并进行1H和13C核磁共振测定。得知该多糖同时存在-糖苷键和-糖苷键，多糖以B-(13)-D-葡萄糖为主链，以B-(16)-D-葡萄糖为侧链，是一种蛋
12、白杂多糖。（2）菌丝体与发酵液中的化学成分据资料报道，液体培养P.1igniarius菌丝体中含有甾醇类物质、虫草酸等，其液体发酵培养菌丝体中经分析得到二丁基羟基甲苯、棕榈酸、9，12-十八碳二烯酸甲酯、二十碳烷、二十六碳烷5种化学物质。Lee等实验发现桑黄胞外多糖有四种组分，分子量围为940015000，其单糖成分主要由甘露糖(3%12%)、半乳糖(2%10%)、葡萄糖(80%95%)组成，该多糖还存在少量由天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸组成的蛋白质。Hye-Jin Hwang等对桑黄胞外多糖的组分与分子结构作了进一步的研究，实验中用体积排除色谱(SEC)和多角度激光散射仪(MALLS)联
13、用测定桑黄菌丝体胞外多糖(EPS)。实验中发现EPS中有三种组分(Fr-，Fr-和Fr-)。用气相色谱测定EPS组成得出EPS的三种组分为不含蛋白质部分的多糖，主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成。根据洗脱体积对组分分布量的图中得出Fr-，Fr-和Fr-的分子量分别为433400(7801)Da，31470(283)Da和12950(90)Da，并计算出各组分的分子量分布，得出Fr-为多分散组分，分子量分布跨度较大，Fr-和Fr-为单分散组分，分子量分布跨度较狭窄。根据每时刻的组分分布量可得出各组分分子的均方根半径(RMS，分子重心到分子边缘的距离)。根据各组分的RMS对分子量的图，可知Fr-分子
14、结构为球形，Fr-分子结构为无规则线团形，Fr-无定形。1.3.3桑黄的人工培养由于自然条件和自身生长周期长等因素的限制，野生的桑黄菌数量极其稀少，而且难以采集，为进一步研究和开发好桑黄，很有必要进行人工培养方面的研究工作。（1）桑黄子实体的人工栽培野生桑黄多生于、柳、桦、桃等阔叶树的枯立木与立木树干上，多年生。我国大部分地区均有分布，但产量很少。国外各大药厂最近几年纷纷投入巨资研制桑黄系列抗癌新药，对桑黄的需求越来越大，价格越来越高，人工栽培桑黄菌，已成为当务之急。目前桑黄人工栽培在国刚刚起步，国仅有一家研究所在省市已与外商合作，引进桑黄菌种，于1995年6月至1996年6月进行了菌种驯化与
15、出菇试验。但只是进行小面积试验栽培，生长期在1.52年。国外市场对桑黄的需求越来越大，野生桑黄资源逐渐枯竭，远远不能满足市场需求10。（2）桑黄多糖的固体培养固体培养就是利用固体培养基进行微生物的繁殖。微生物贴附在营养 基质 表面生长，所以又称为表面培养。固体培养在微生物鉴定、计数、纯化和保藏等方面发挥着重要作用。桑黄是丝状真菌，可进行生产规模的固体发酵。但大规模的固体发酵桑黄还未见报道。（3）桑黄多糖的液体培养液体培养就是将微生物接种到液体培养基中进行培养。具体包括（1）浅层液体培养：在好氧微生物静止培养中常常将培养液装成浅层以增大培养液与空气的接触面积，使氧不至于成为限制因子；（2）利用摇床作三角瓶的液体振荡培养； （4）深层培养大规模液体培养都是采用更先进的深层培养。从深层液体培养器底部通入加压空气，并用气体分布器使空气以小气泡形式均匀喷出。由于天然的桑黄子实体很少，目前子实体的工栽培仅小批量获得成功，满足不了市场需求，能借助于菌丝体发酵来大量获得桑黄多糖，因此桑黄的深层发酵目前占主流地位。全采用液体发酵技术，人工培养获得了具有一定生物活性的菌丝体。而日本与国开发利用桑黄最早，并已开始人工栽培，批量生产。国通过试验获取
