实验二细菌的染色和细菌细胞构造的观察染色是观察微生物的一种重要方法由于微生物细胞含有大量水分 ，一般在80%-90%以上,对光线 的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明 暗差所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下 都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察一、目的要求1 .学习微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术2 .掌握细菌的一般染色法和革兰氏染色法3 .进一步熟练显微镜油镜的使用技术4.观察和识别细菌细胞的特殊构造二、染色剂和染色的原理微生物染色白^基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进行的物理因 素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等细菌的等电点较低小pH值大约在2-5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌 体蛋白质电离后带 负电荷;而碱性染料电离时染料离子带正电荷因此，带负电荷的 细菌常和带正电荷的碱性染料进行结合,所以在细菌学实验室中常用碱性染料进行 染色染色剂是一种供染色用的有机化合物，当前普遍采用的染色剂是含有苯环的有 机化合物，染料分子都由苯环、连接在苯环上的染色基团（或称呈色基团，色基和助 色基因（或称作用基团三部分组 成、助色基团具有电离特性，电离后带有正或负电荷 的染料离子便能与细胞有较牢固地结合，使其呈现颜色。
染料可按其电离后染料离子所带电荷的性质分为酸性染料、碱性染料、中性 （复合染料和单纯染料四大类1酸性染料这类染料电离后染料离子带负电荷、如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺 黑等,可与碱性物质结合成盐2碱性染料这类染料电离后染料离子带正电荷、可与酸性物质结合成盐微生物实验室一 般常用的碱性染料有 碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫 等，在一般的情况下，细菌易被碱性染料染色3中性（复合染料酸性染料与碱性的结合物叫做中性（复合染料，如伊红、美兰等，瑞脱氏（Wright 染料和基姆 萨氏（Gimasa染料等，后者常用于细胞核的染色4单纯染料这类染料的化学亲和力低，不能和被染的物质生成盐，具染色能力视其是否溶于 被染物而定，因为它们大多数都属于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏 丹类（Sudan b的染料微生物染色常用的染料如表2-1所示表2-1各种染料的特性与用途三、实验材料1 .涂片染色用的细菌培养物(1大肠杆菌(Escherichia coli24h的斜面培养物2枯草杆菌(Bacillus subtilis12-16h的斜面培养物2 .载玻片、接种环、银子、酒精灯、各种染色液、火柴、无菌牙签、玻璃铅 笔、蒸储水。
3 .显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、二甲苯等4 .示范片(1苏云金芽抱杆菌(Bacillus thuringiensis的芽抱；(2胶质芽抱杆菌(Bacillius mucillaginosus的荚膜；(3枯草芽抱杆菌的鞭毛四、实验程序(一细菌染色的方法染色的方法一般分为单染色法(又称一般染色法和复染色法(又称特殊染色法两 种简单染色 法是用一种染色液染色菌体后，就可以观察微生物的大小、形状和细 胞排列状况，但不能鉴别微生物以 及它的特殊构造等复染色法是用两种或两种以 上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法常用的复染色法 有革兰氏染色法和抗酸性染色法，还有鉴别细胞各部结构的如芽抱子染色法、荚膜 染色法、鞭毛染色法、细胞核染色法等的特殊染色法二细菌染色的方法和步骤微生物染色技术白一般过程如下：涂片一干燥一固定一染色一媒染一脱色一复染一水洗一干燥一镜检1.简单染色法(一般染色法(1菌种:牙垢细菌2涂片:取洁净无油污的载玻片一块，在玻片中心加一小滴蒸储水，用无菌牙签取 牙垢少许，涂于玻片的水滴中，并涂成直径约为10mm的均匀薄层，用过的牙签的立 即投入废物桶3干燥:让涂片自然气干或将涂面朝上在酒精灯上高处微微加热 ，使水分蒸发但 切勿紧靠火焰 或加热时间过长，以防标本烤焦而变形。
4固定:将已干燥的涂片，涂面朝上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过 2〜3次， 杀死微生物，固定细胞结构便于染色待玻片冷却后再加染色液5染色:将涂片置于水平位置上，在整个涂面上滴加齐氏石碳酸复红染色液，染色 1min左右通常染色时间的长短取决于菌体、染色液的种类和它的浓度6水洗染色时间一到，倾去染色液、并用自来水细流冲洗涂片，洗至流下的水中 无染料颜色为止7干燥:在空气中自然干燥，也可用吸水纸吸去载玻片上的水，但应注意不能将滤 纸在涂面上拖擦8镜检:干燥后的载片标本可用显微镜观察、从低倍到油镜 ，在油镜下观察牙垢中的各种细菌 形态，并绘出典型的视野图2.革兰氏（Gram染色法革兰氏染色法是复（特殊染色法中一种最重要的鉴别性染色法之一于 1984年由丹麦病理学家Gram所自J立，最初是作为观察组织切片中细胞之用，后因其可将所 有的细菌区分为差别明显的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌两大类，从而成为检验细菌 中最常用的鉴别染色方法该染色法是先将细菌用结晶紫染色，再加媒染剂碘液媒染以增加染料和细菌细 胞的亲和力，使它和结晶紫在菌体细胞壁部位形成分子量较大的紫碘复合物 ，而后用脱色剂酒精或丙酮脱色，最后再用复染剂番红复杂。
如果细菌经脱色剂酒精或丙酮 处理后不被脱色而保存初染颜色即紫色，即为革兰氏阳性菌”若初染被脱色而染上 复染剂番红颜色即淡红色，则为革兰氏阴性菌革兰氏阳性细菌一一紫色,也写作G+;革兰氏阴性细菌一一红色,也写作G-o革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤 ，但在具体操作方法上有多种做法1涂片取一块洁净的载玻片，用特种铅笔在载片的左右侧，注上菌号，并在载片两端各滴 一滴蒸储水将 接种环在火焰上灼烧灭菌，以无菌操作法（见图2-1在（1号菌（见实验 材料菌苔上挑取菌体少许，注意不要挑起培养基放在载玻片一端的水滴中，涂成均 匀的薄层、接种环使用后必须立即经再次火焰灭菌，才可放下再用经火焰灭菌过 的接种环取(2号菌苔涂片、并按照简单染色法的操作进行干燥固定2染色①初染将涂片置于水平位置上，在做好的左右涂面上滴加草酸俊结晶紫染色液，染色 1min0然后倾去染色 液用自来水细流冲洗至洗出液中无紫色②媒染先用新配的路哥氏碘液冲去涂片面上的残水，再用路哥氏碘液覆盖涂面媒染1min,然后水洗③脱色除去残余水后滴加95%酒精进行脱色至玻片上流下的酒精液中紫色接近消失 为止，约30seG并立即用自来水细流冲洗，终止酒精的作用。
④复染滴加番红染色液染色1min水洗后用吸水纸吸干各步骤见图2-23镜检在油镜下观察染色后的大肠才f菌和枯草杆菌加以鉴别，并绘图说明染色的结图2-1涂片过程的无菌操作图2-2革兰氏染色程序3.芽抱染色法（示范芽抱染色法是为了观察细菌芽抱时使用的一种特殊染色法细菌的芽抱含水量 少脂肪含 量较高，芽抱壁较厚对染料的透性差，不易着色但是一旦着色后又难以脱 色通常，芽抱染色采用弱碱性染料孔雀绿在加热的条件下进行 ，染色完毕，用自来水 冲洗因孔雀绿是弱碱性染料，与菌体结合较差，因此易被水冲洗掉，而芽抱中的孔雀 绿却难于溶出水洗后，再用一种呈红色的碱性染料加以复染结果菌体即被染成 红色，芽抱呈绿色1涂片:取在牛肉膏蛋白陈琼脂外面上培养 24-28h的苏云金芽抱杆菌涂片、固 定，操作方法与 简单染色法相同2染色:在涂片面上铺一层滤纸片，在滤纸片上滴加孔雀绿染色液，使滤纸片湿润 再放在水浴 锅上以蒸汽加热至冒蒸汽(或其它热源上加热也可，在涂片处不断添加孔 雀绿染色液勿使干涸，勿使沸腾，又冒蒸汽，维持5-10min,冷却后水洗至流出水无绿 色为止，再用番红染色液复杂1min,水洗、用吸水纸吸干、镜检3油镜下观察，并绘图。
芽抱呈绿色，菌体呈红色4 .荚膜染色法(示范荚膜是细菌在新陈代谢过程中形成的并分泌于细胞壁外的粘液状物质主要化 学成分是多糖类物质荚膜的折光性低，与染料的亲和力差，不易着色，但荚膜的通透性较 好，某些染料可 透过荚膜而使菌体着色，因此染色后在菌体周围有一浅色或无色的透 明圈，即为荚膜荚膜染色常用背景衬托染色法，即用有色的背景来衬托出无色(没有染上颜色的 荚膜有时也可 用单染色来进行染色荚膜薄，易变形，因此在涂片过程中不能用加 热来固定(1制片取在细菌斜面上培养72h左右的胶质芽抱杆菌涂片，涂片方法同简单染 色法,自然干燥，自然固定2染色:在已自然晾干的涂面上，滴加1%结晶紫染色液染色2min,以20%硫酸铜 冲洗数次再用自来水冲洗1次,晾干3镜检:油镜观察荚膜示范镜并绘图菌体呈红色，荚膜则无色5 .鞭毛染色法(示范细菌的鞭毛极细，直径约0.01 pm〜0.02小向普通光学显微镜的辨晰度以外首先用媒染剂染色，使其吸附在鞭毛上再用石碳酸复红液等复染，使鞭毛加粗，达 到普通光学显微镜的辨晰限度以内有鞭毛的细菌只有在一定的个体发育阶段才 产生鞭毛一般在外界条件适宜时，幼龄培养体易生鞭毛，尤其是在短期内经过多次 反复移种的培养体，更易产生鞭毛。
染色时，还必须采用 新鲜的染色液和非常洁净的 载玻片，才能保证染色的质量1菌液的制备及涂片用于染色的菌种应预先连续移接 5〜6代染色前用于接种的培养基应用新鲜配 制的细菌加富培养基，表面较湿润①接种:先在斜面底部加入0.5-lmL无菌水，取经活化的枯草杆菌以无菌操作法 取1至2环菌苔，接种于斜面底部的无菌水中，在30?C温度下培养15-18h,让生长旺 盛的枯草杆菌由水面向上 爬行”生长②制备菌液：用接种环轻轻挑取斜面底部近水面处 自行爬上”的菌苔数环，小心 而又轻微地移入 盛有1 mL与菌种同温的无菌水中，不要搅动，让有活动能力的菌体 游入水中，使菌液呈轻度混浊、并在 28?C箱中保温10min,让老菌体及其它杂质下沉 使幼龄菌体在无菌水中自由运动以松散鞭毛无标题文档 页码，6/8③鞭毛涂片：涂片之前，用悬滴法观察其运动性，若运 动性很强，即可涂片用接种环（或用毛细 管）在液面上挑取或吸取菌液数滴，置于载玻片的一端，稍稍倾斜玻片，使菌液缓慢地流向玻片的另一 端在载片表面形成菌液带，置玻片于空气中自然干燥、固定也可取菌液点样，占成梅花形，自 然干燥、固定注意不能用加热干燥方法固定 （2）染色 染色液必须新配制的。
涂片必须充分晾干才能染色 ①先用刚过滤的鞭毛染色液 A染色7.5至8min左右②倾去A液，再加鞭毛染色液B染色3-5min,水洗，自然干燥 ③用C 滚石碳酸复红复染2min,水洗晾干，镜检 菌体与鞭毛都呈红色 （3）油镜下观察鞭毛的数目及着生情况（周生鞭毛示范镜）并绘图 思考题1.简单染色法中各步骤的注意事项是什么？ 2.要得到正确的革兰氏染色结果必须注意那些操作？关键在哪几步？为什么？ 附录本实验中几种染色液的配制方法 1 .吕氏（Loeffler）美兰染色液 A 液：美兰（Methylene blue） 0.3g 95%酒精 30mL B 液： 氢氧化钾（KOH） 0.01g蒸储水100mL分别配制A液体和B液然后混合即成2. 齐氏（Ziehil）石碳酸复红染色液 A液：碱性复红（Basic fuchisin） 0.3g 95%酉精 10.0mL B液：石碳酸（酚）5.0g蒸。