鸡成纤维细胞传代培养

《鸡成纤维细胞传代培养》由会员分享，可在线阅读，更多相关《鸡成纤维细胞传代培养（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、辽宁农业职业技术学院毕业论文系别：生物技术系专业名称：兽药生产与营销论文题目：鸡胚成纤维细胞传代学生姓名：郐永琳指导教师：评 阅 人：成绩：二 O 一 O 年六月二十日项目题目摘要关键词内容格式答辩合计权重53270515100得分评阅人评语：评阅人签字：年月日目录摘要关 键 词 1前言11 材料 11. 1 仪 器 11. 2 种 蛋 11. 3 犊牛 血清 11. 4 溶 液 12 方法 22.1 鸡胚的选择与孵化 22.2 鸡胚原代细胞制备 22. 3 细胞 传代 43 结果与分析 44 讨论 44. 1 温 度 44. 2 P H 54. 3 气 体 54. 4 细 胞 接 种 量 5

2、4. 5 无 菌条 件 55 结论 5参 考 文 献 6致谢6鸡胚成纤维细胞传代摘要：采用 10 日龄 SPF 鸡胚，进行消化，制备原代细胞，当细胞长成良好单层时，按 1:2 比例进行细胞传代，找出鸡胚细胞传代方法和情况。其结果是：按本实验室方法进行鸡胚传 代，传至 20 代以上细胞形态没有发成变化，细胞生长良好。细胞数量大大增加。为病毒的 研究和疫苗生产提供条件。关键词：鸡胚；传代；生长特性前言细胞培养的方法是将机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、 螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞 得以生存、生长和繁殖。细胞在培养瓶长成致密单

3、成后，已基本饱和，为使细胞能继续 生长，同时也将细胞数量扩大，就必须传代（再培养）。也是将细胞保存下去的方法。 同时也是利用培养细胞进行各种操作的必经过程，在这个过程中可以掌握其操作过程又 能观察到细胞的生长情况。1 材料1.1 仪器培养箱、培养瓶、玻璃漏斗、吸管、移液管、纱布、水浴锅、手术剪、镊子、培养 皿、烧杯、瓶塞、培养盘、蛋托、超净工作台、显微镜、三角烧杯、95%酒精、75%酒精 棉、碘酒棉、废液缸等。1.2 种蛋SPF 种蛋，由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。1.3 犊牛血清多用胎牛或犊牛血清。由颈动脉无菌放血。采血前先向瓶内加些等渗盐溶液湿润瓶 避，采血后置室温或37C温箱

4、内待血液完全凝固后，有灭菌玻棒将血块自瓶壁分离。随 后再置室温或4C冰箱内一天，即可吸取血清，如有少量红细胞可离心沉淀除去。经滤 过除菌分装，置-20C冻存，使用前56C水浴中灭活30min。1.4 溶液1.4.1 Hank,s 液 NaCl16g、Na HPO 0.304g. KCl 0.8g、KH PO 0.12g、MgSO 0.4g、CH O242446 12 62g、CaCl 0.28g、酚红2mL、水解乳蛋白10g、加蒸馏水至2000mL高压灭菌116C30min。21.4.2 酚红 苯酚红 1g、NaOH0.12g 加蒸馏水至 200mL。1-4-3 7.5%NaHCO3溶液 Na

5、HCO 6g、加蒸馏水至 80mL 高压灭菌 116C30min。31.4.4 EDTA 胰蛋白分散液（滤过）NaCl8g、NaHCO o.5g、KClO.4g、胰蛋白酶 0.5g、3CH O lg、EDTA0.2g、1%酚红 0.2mL 加蒸馏水至 1000mL。6 12 61.4.5 消化鸡胚用胰酶液（滤过）NaCl8g、KH po 0.06g. KCl0.4g、胰酶 2.5g、CH O246 12 6lg、1%酚红 2mL、Na HCO 0.152g 加水至 1000mL。231.4.6双抗（滤过）青霉素200万单位、链霉素200万单位加蒸馏水至200mL。1.4.7 MEM 液（滤过）

6、MEM9.606g、NaHCO 2.2g 加蒸馏水至 1000mL。32 方法2.1 鸡胚的选择与孵化应选健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。受精蛋最好不含有母源抗体，特别是 针对培养病毒的抗体，为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好；蛋壳要干净， 孵化前最好不洗。卵必须新鲜用孵卵箱孵化，一般不宜保存过长时间，通常保存期不应 超过10天，即5天以内最好，而且不宜在高温下保存，通常保存于420C，以10C 条件下最好。要特别注意温度、湿度和翻蛋。孵化条件一般选择相对湿度为60%，最低 湿度36%, 般37.539C。每日翻蛋最少3次，并注意空气流通，大头向上，注意鸡 胚位置。孵化34天，可

7、用照蛋器在暗室观察，鸡胚发育正常时，可见清晰的血管及活的 鸡胚，血管及其主要分支均明显，呈鲜红色，鸡胚一直在活动。未受精和死胚胚体固定 在一端不动，看不到血管或血管消散，应剔除。2.2 鸡胚原代细胞制备221营养液的配制在Hank，s液中加入青霉素、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL， 链霉素100IU/mL，再用7.5%NaHCO调整PH至7.27.4；置4C冰箱保存，将胰蛋白酶3PH值调整为7.6，分装于小瓶中，置-20C冰箱保存。操作前将Hank，s液和胰蛋白液置 37C水浴锅中预热备用（注意，胰蛋白酶溶液不宜反复冻融）。2.2.2 取胚及剪碎 取10日龄鸡胚，在超净工作台内，将胚

8、蛋气室端向上放置，在气室 部用5%碘酊消毒后，75%酒精棉脱碘，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜、绒尿膜、羊 膜，取出胚胎于灭菌平皿中。减去头部、翅、爪及内脏，用PBS或Hanks液洗去体表 血液，移入灭菌三角烧瓶中，用灭菌剪刀剪碎剩余鸡胚组织，使之成为12mm大小的 碎块，加PBS或Hank, s液轻摇，静置12min，使之组织块下沉。吸去上层悬液，依同 法再洗 2 次，至上悬液不混浊为止，吸完 Hank，s 液，组织碎片置三角瓶底。2.2.3 消化 置水浴锅内取出预热的胰酶，按组织块量 56 倍加入烧杯中（每个胚 510mL），三角瓶上加塞，以免CO挥发及污染。37C水浴1030min,由于

9、胰酶作用，使2细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，此时再轻摇三角瓶，可见组织块悬浮在液体内而不 易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化 不够，则细胞不易分散。消化完全后，加入培养液以终止胰酶消化作用。224细胞分散取出三角瓶后静置2min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用Hank，s液 反复清洗 3 次，以洗去胰酶，尽量吸完上清液，留下组织块。加 2mL 含血清的 MEM 培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞冲散，此时可使营养液混浊即为细胞悬液，静置1min，使未冲散的组织块下沉后，上层细胞悬液通过带68 层纱布的漏斗过滤一次；进行细胞计数，静置培养时将细胞悬

10、液调成含 100 万250 万个细胞/mL。2.2.5 细胞分装培养 将集细胞瓶中的细胞摇匀，再加入适量的营养液，使每毫升含细胞50万60万个左右,按细胞液总量10%加入犊牛血清、双抗100IU/mL，调节PH值为7.0 7.2，用正压方法将细胞分装到细胞培养瓶中，每瓶1000mL （细胞瓶容量1%）。分装完 毕，在火焰控制下，除去分液管道，将细胞培养瓶塞上各管管口换上一头塞有棉花的胶 头开口折扎好，在瓶颈以上用40cmX40cm的牛皮纸将瓶口及胶塞包扎好送温室转瓶培 养；细胞培养液的营养成分含量相对来说是固定的，它只能支持一定数量细胞生长与分 裂，原代细胞培养细胞的数量不宜太多，否则细胞分裂

11、后，营养液中的氨基酸含量因消 耗而下降、营养液的营养水平难以维持，反过来还会限制细胞的生长。2.2.6 细胞观察 单层细胞培养，由于细胞具有停泊依赖性，细胞必须贴附在瓶壁上才能 生长，让它悬浮在液体介质中（如悬浮在营养液或维持液中），细胞很快就会死亡。原 始的单层细胞培养液的工艺方法比较简便，只要培养容器和培养液能满足分裂繁殖需 要，密封性好，完全可以达到培养的目的。（1）细胞瓶置转瓶架上，要随时查看转动情况；在48h内严禁搬动，7296h要逐 瓶检查细胞生长情况，并记录生长情况和细胞密度。培养细胞一般于 24h 左右开始分裂；（2）出使时细胞分裂形成若干个细胞岛，以后再连成片，培养2496h

12、后大都能 形成致密单层；3）判别细胞生长情况常以贴壁好坏作为标准，用下列符号对细胞生长情况进行评估；-）：表示细胞不贴壁或贴壁不分裂；（+）：细胞贴壁伸展或形成孤立细胞岛，其覆盖面积占瓶壁的25%左右；（+）：细胞分裂成较大的岛状，覆盖面积占瓶壁50%或50%以上；（+）：细胞覆盖面积达瓶壁75%以上，透明度好，立体感强； （+）：细胞满瓶覆盖，形成致密单层，透明度好，立体感强，形态丰满。2.3 细胞传代选取生长良好、以形成致密单层（+）的细胞培养瓶；在无菌室中，于每瓶细胞 中加入lOOmL左右的分散液（EDTA）。加液后，轻而快地转动细胞瓶，使EDTA与瓶壁细 胞充分接触，并随时注意观察瓶壁

13、上细胞层的变化情况。待瓶壁上细胞层开始出现轻微 的龟裂（像干旱水田的干裂缝隙样）时，立即倒去EDTA，加入营养液（含牛血清10%, 双抗0.5%PH6.87.0的乳汉液）充分摇动，使营养液沿瓶壁转动冲刷壁上细胞，直至 细胞完全脱落为止。然后按所需要量加入营养液，摇匀后分装。分装率为1:2如为传代 细胞系，其分装率可提高到1 ：3甚至1:4。做好标记放37C培养箱中培养。3 结果与分析共消化7批细胞， 01批细胞和06批细胞分别与消化后48小时、02批细胞传至第3代时，细胞形态发生变化，产生细胞病变，培养液发生混浊，确定为细菌污染。03批细胞和04批细胞传至第5代时，细胞形态发生变化，产生细胞病

14、变，但是培养液没有发生混浊，可能是病毒污染所致。05批细胞传至第11代时，细胞形态发生变化，产生细胞病变，培养液发生混浊，确定为细菌污染。07批细胞传至20代时，细胞能够与4872小时长成良好单层，从21代后细胞生长开始缓慢，传至24代时7天后也没有长成单层。出现这种情况的原因有待进一步研究。见表1。表1 各批次细胞传代情况批次01批02批03批04批05批06批07 批代次0244100204 讨论影响细胞生长的因素很多，除了生长液和维持液因素外，还有以下主要因素。4.1 温度细胞培养的最适温度与细胞来源的动物体温相似，一般为3738C,高温易导致细 胞死亡，低于可减慢或终止细胞的增殖。4.

15、2 PH细胞培养最适PH 一般为7.07.4,因细胞种类不同而稍有差异，通常以不低于6.8 和超过7.6为宜，当低于6.8和超过7.6时，对细胞生长会有抑制作用。4.3 气体细胞生长需要O和CO。再用橡皮塞密封的培养瓶内，由于生长液中的_HCO及细胞223生长时分解糖而排出CO。可供细胞代谢的需要。如用CO培养箱培养，则更有利于细胞22生长，培养瓶不需要密封。4.4 细胞接种量细胞浓度与形成细胞单层的速度成正比。当细胞贴壁以后，细胞代谢过程中产生刺 激细胞分裂物质，这种物质需要达到一定浓度时才能促进细胞的分裂繁殖，细胞量过少， 排出的刺激细胞分裂的物质少，作用小，而细胞不易形成单层，容易死亡，但接种量过 大，形成单层后很快脱落，致使死细胞和细胞碎片对分裂细胞发生毒性作用，导致细胞 生长受到抑制，甚至死亡。细胞接种量因细胞种类不同而有