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1、 常州工程职业技术学院 毕业设计报告（论文） 系 别： 制药与生物工程技术系 课题名称： 弗氏柠檬酸杆菌TPL基因的体外扩增 指导教师： 班 级： 生物制药1021 学生姓名： 1摘 要聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)是最常用的分子生物学技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增。本实验是以基因组 DNA 为模板，利用PCR 技术从弗氏柠檬酸杆菌( Ci trobacter f reundii ) 中扩增得到含有酪氨酸酚解酶（the Tyrosine Phenol Lyase，简称TPL）基因的有效DNA 片段，得到大量的有效基
2、因。PCR技术产生时间虽不长，却以惊人的速度广泛应用于分子生物学各领域。PCR技术能够快速特异地扩增任何目的基因或DNA片段，它不仅可以用于基因分离、克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制探查、法医鉴定等诸多方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将大大推动分子生物学各学科和研究进展。关键词：弗氏柠檬酸杆菌 TPL 基因 PCR 扩增AbstractPolymerase Chain Reaction (PCR) is one of the common techniques in molecular biol
3、ogy, which can amplify nucleic acids through the cycle of denaturation， annealing and extension. Tyrosine phenol lyase gene-containing DNA fragment was amplified from Citrobacter freundii, get a lot of effective gene using PCR technology. PCR technology generation time is not long, but it is widely
4、used in various fields of molecular biology at an alarming rate. PCR technology can quickly and specifically any desired gene or DNA fragment was amplified, It not only can be used for gene isolation, cloning and DNA sequencing analysis can also be used for the construction of mutant and recombinant
5、, the study of the regulation of gene expression, gene polymorphism analysis, genetic disease and infectious disease diagnosis, tumor mechanism explorationThe forensic identification, and many other aspects. PCR technology has become a revolution on the methodology, it will greatly promote the vario
6、us disciplines of molecular biology and research progress.Key words：citrobacter freundii gene PCR TPL amplification常州工程职业技术学院毕业设计（论文）目录1 前言21.1络氨酸酚裂解酶31.2. PCR技术31.3 立题依据和研究内容41.3.1 立题依据.41.3.2 研究内容.42实验原理52.1 SDS法制备基因组DNA52.2 琼脂糖凝胶电泳原理52.3 PCR反应原理63实验器材与步骤83.1实验材料83.1.2实验试剂83.2实验仪器93.3实验步骤93.3.1菌种培
7、养.9.3.3.2 SDS法制备细菌基因组DNA103.3.3电泳检测113.3.4 PCR124 实验结果和注意事项134.1实验结果134.2分析及注意事项.155结论16致谢16参考文献161前言1.1 酪氨酸酚裂解酶左旋多巴又称L-多巴，为酪氨酸的羟化物，在体内是左旋酪氨酸合成儿茶酚胺的中间产物。左旋多巴一直是帕金森病治疗的金标淮。在帕金森症状的治疗中,左旋多巴比其他所有药物都更有效,这可能是由于其产物（多巴胺）是一种能同时作用于纹状体内两种多巴胺受体的生理性神经递质,而许多激动剂仅仅激活D2受体。引起异动和症状波动虽与应用左旋多巴有关,但其根本原因是黑质的严重破坏。未来左旋多巴新给药
8、方法的思路包括应用药物的新剂型,如经皮钻贴剂、鼻腔喷雾剂、咀嚼片以及缓释剂等1。 L-DOPA的衍生物多巴胺是一种重要的神经递质，由于多巴胺不能透过血脑屏障进入脑组织，所以不能通过补充多巴胺来治疗帕金森氏病，而L-DOPA可以通过血脑屏障，并在脑组织中脱羧形成多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加而达到治疗的目的。Birkmayer于1961年用左旋多巴治疗PD获得明显疗效2。L-DOPA及复方左旋多巴（如美多芭）已成为治疗常见老年病帕金森氏病的主要药物3,4。 1.2 L-DOPA生产的国内外研究进展 1911 年，Casimir Funk 在实验室中第一次成功合成 D,L-DOPA。1913
9、，MarcusGuggenheim从蚕豆的豆荚中第一次分离提取到天然存在于植物体内的 L-DOPA2。综合国内外研究状况，目前，L-DOPA 主要通过从植物中提取、化学法合成以及微生物酶法转化等方法生产获得。上世纪70年代初，国外化学法合成L-DOPA的年产量已达150吨，但由化学法所合成出来的产物是D-型和L-型的混合物，而D-DOPA会引起人体毒性反应5，因此应用于医学临床之前必须通过控制旋光度的方法来减少D-DOPA的影响。解决此问题的最好办法是使D-型和L-型多巴完全分开，但D-型和L-型多巴的拆分非常困难。所以越来越多的研究者开始寻求新的L-DOPA获得途径。 1.3 生物合成L-D
10、OPA 上世纪 60 年代，国外许多学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。Larway 和Evans首次在嗜酪氨酸微螺菌（Microspiratyrasinatica）中发现了与L-DOPA形成有关的酪氨酸酶6。随后，John等在蜡状芽孢杆菌（Bucillus cereus）中也发现酪氨酸酶，并用来生产L-DOPA。为了提高L-DOPA产量和底物转化率，研究者们对微生物酶法合成L-DOPA的工艺方法进行了大量研究。酪氨酸酚裂解酶，又名-酪氨酸酶，以磷酸吡哆醛为辅酶，TPL可以催化L-酪氨酸发生-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个反应是可逆的，将邻苯二酚代替苯酚后，可由邻苯二酚、丙
11、酮酸和氨可在TPL催化下生成L-DOPA。近年来，随着分子生物学技术的发展，一些学者开始运用基因工程的手段从含有TPL基因的野生菌株染色体DNA中克隆得到TPL基因片段，将其连接到不同的载体上构建重组质粒，然后转入宿主细胞中进行表达。1.2 PCR技术聚合酶链式反应（polymeras chain reaction，简称PCR）是近十几年发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一，是一项在短时间内大量扩增特定的DNA片段的分子生物学实验技术。它具有强大的扩增能力，并且可与其他分子生物学方法和免疫学方法相结合应用，使其敏感性和特异性都大大增强。由于PCR对世界生物医学研究的巨大推动作用，其发明者Sa
12、iki因而获得1992年诺贝尔医学奖。随着生命科学和经济的不断发展，人们对医药水平的要求在不断的提高。PCR技术以惊人的速度广泛应用于分子生物学各领域。PCR技术能够快速特异地扩增任何目的基因或DNA片段，并很容易使得微微克（pg）水平的起始物达到毫微克（ng）水平的量。它不仅可以用于基因分离、克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制探查、法医鉴定等诸多方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将大大推动分子生物学各学科和研究进展。 PCR可以由体外酶促合特异DNA片段，通过高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应
13、组成一个周期，循环进行，使目的基因得以迅速扩增。其主要步骤是：待扩增DNA于高温下解链成为单链模板；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚合酶在72将单核苷酸从引物3端开始掺入，沿模板53方向延伸，合成DNA 新股。由于每一周期所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经过25-30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上至少可扩增105倍，一般可达106-107。1.3本课题的立题依据和研究内容1.3.1 立题依据酪氨酸酚裂解酶（Tyrosine Phenol-lyase，TPL，EC 4.1.99.2）也称-酪氨酸酶，
14、在生物体内催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为L-酪氨酸，而L-酪氨酸常作为营养补充剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸，是L-多巴的重要制备原料。此外，该酶在磷酸吡哆醛的作用下，能够催化一系列的、消除反应、取代反应以及、消除反应和消旋反应的逆转。因此TPL是一种广泛应用于医药行业的酶类，解决它的大规模工业化生产是一个迫在眉睫的问题。本课题应用分子生物学手段，通过PCR体外扩增技术，体外合成目的基因，并扩大培养，得到目标产物，简化了生产过程，为生物制剂的大规模工业生产提供了一定的借鉴。1.3.2研究内容（1）弗氏柠檬酸杆菌的培养（2）目的基因的构建与体外扩增（3）表达产物的鉴别2 实验原理2.1 SDS法制备基因组DNA的原理细菌基因组DNA （染色体DNA）的提取一般
