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1、基因组学与蛋白质组学的联系要点染色质存在于真核生物细胞核内，由蛋白(组蛋白、酶和转录因 子等)以及DNA和RNA分子组成。染色质参与了许多主要生物过 程的调节，包括细胞特异性或组织特异性的表达模式、DNA复制及 修复、基因表达的机制。了解基因表达在体内如何进行成为现代生物 学最诱人的挑战之一。染色质免疫沉淀法(Chromatin immunoprecitation，ChIP )在这个背景下应运而生，成为目前研 究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。与传统的EMSA技术相 比，基于体内分析而发展起来的ChIP能更真实、完整地反映结合在 DNA序列上的调控蛋白，是目前研究基因表达的机制、建立遗传
2、网 络、鉴定转录因子和它们的靶点的最常用方法。ChIP还可与DNA芯片和测序技术相结合，用于高通量的筛选 已知蛋白因子的未知DNA靶点和研究反式作用因子在整个基因组上 的分布情况，这将有助于深入理解DNA-蛋白质相互作用的调控网 络,了解一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。基因组学和蛋白组学都将把染色质作为研究对象，但两个领域采 用的方法各异。在基因组学研究中，研究人员通常从一个蛋白质开始 研究，采用ChIP去找出与基因组关联的蛋白质。而蛋白组学研究采 用的是反向方法先用一个特殊的DNA序列作为寻找蛋白质的诱饵； 然后用ChIP去证实：那些蛋白质就是在体内与DNA序列相关联的
3、 蛋白质。ChIP的原理很简单，就是选择性地富集包含某一特定抗原的染 色质片段。传统的ChIP包含以下几个步骤：甲醛处理使蛋白质与DNA交联；超声波将染色质打断成一定大小；通过抗体沉淀蛋白质 -DNA交联复合体；用蛋白酶K处理，解除交联，纯化DNA ;实 时定量PCR检测DNA的量。虽然ChIP技术的原理不复杂，但是对 技术的要求高，实验步骤的设计摸索耗时耗力，实验耗费时间长。ChIP实验的几个关键因素：1抗体对于ChIP实验来说，抗体的选择可以说是至关重要。首先，应 该检验抗体的特异性。我们可以用ELISA和Westernblot来确认抗 体是否识别特异的表型。但是充分的验证也不能确定抗体一
4、定能在 ChIP中起作用，因为交联处理可能会使某些表型改变或丢失。尽量 避免使用识别多个抗原的抗体。最好选择ChIP级别的抗体，如果实 在找不到，普通IP的抗体也是一个不错的选择。其次，抗体的量和 使用的条件都应该根据使用经验来确定。一般情况下可以从每 50ugDNA使用2-5ug抗体作为起始条件开始摸索。抗体孵育的时 间可根据实际情况缩短或延长，如果细胞数量有限的话，还是推荐孵 育过夜吧。2染色质大部分来源的染色质都适合做ChIP。然而由于来源不同，分离 的步骤又随之变化，ChIP可以分为两种类型：天然的和交联的，分 别简称为N-ChIP和X-ChIP。N-ChIP :以天然的染色质作为底物
5、。这种方法的好处就是抗 原不会在化学交联中被修饰。然而，如果缺乏了交联的步骤，就意味 着只有与染色质结合非常紧密的蛋白质能被免疫沉淀，譬如组蛋白。(2) X-ChIP :以交联的染色质作为底物。X-ChIP应用更为广泛 的原因就是能用于研究大范围的染色质结合因子，它们与DNA的结 合力较弱。它也适用于酵母的ChIP，因为酵母的天然染色质很难制 备。然而，确实有一些抗原不适合用X-ChIP这种方式，因为在交联 过程中它们的表型会发生变化，或出现包涵体。交联方式通常是甲醛 处理。一般需要进行一个时间进程的实验来确定交联的时间。3.超声波打碎DNA在X-ChIP中，超声波处理是打碎DNA最常用的方法
6、，因为甲 醛的处理限制了酶切的效果。超声波处理的条件要自己来优化，不过 说明书上通常都会给出一个参考条件。注意在整个超声波处理的过程 中一定要保持细胞在冰上，且时间不宜太久，否则样品会过热并变性。 另外，还要避免产生泡沫，因为泡沫会降低剪切效率。如果出现泡沫， 你就要检查一下是不是探头位置不对，刚好接近液面或接触到了管 底。染色质免疫沉淀作用在基因组学和蛋白组学研究中的应用越来 越广泛。虽然如此，对于使用该技术的新手，它却不是那么容易驾驭 的。对于刚刚开始采用ChIP技术的研究人员来说，试剂盒和相关的 服务是很有用的，因为技术要求很高。如果不想自己慢慢摸索条件， 生物通为你特别介绍市面上主流的
7、商品化产品：R&DR&D最新推出了一系列用于ChIP分析的ExactaChip试剂盒， FoxP3(Catalog#ECP3240),beta-Catenin(Catalog#ECP1329),p5 3(Catalog#ECP1355),Smad4 (Catalog#ECP2097),和 STAT5a/b (Catalog#ECP2168)。这一系列试剂盒可以简便快速地鉴定转录因 子在基因组DNA上的结合位点。在免疫沉淀交联的转录因子-DNA 复合物后，用普通的PCR和基因特异的引物来检测转录因子结合位 点。每个ExactaChip试剂盒试剂盒包含了一个免疫沉淀的抗体和一 对已知转录因子结合D
8、NA序列的引物作为阳性对照。研究者通过自 己设计的引物，就可以发现转录因子结合的其他区域。ExactaChip 试剂盒的最大特点就是摒弃了耗时的反交联和抗体过夜孵育的步骤， 在4-5小时内就能完成整个实验，而传统的方法需要2-4天。缺点 就是里面的试剂不全，像蛋白酶抑制剂、链酶亲和素磁珠、DNA纯 化试剂盒等都要再另外购买，初次使用者可能觉得不太方便。PromegaPromega公司也在去年推出了第一个不需要抗体的新颖ChIP 系统-HaloCHIP系统。HaloCHIP系统利用了 HaloTag蛋白的特点- 能与任何蛋白融合，并与不同的配体包括HaloLi nk树脂产生共价作 用。这样，感兴
9、趣的DNA结合蛋白就可以通过克隆到HaloTag载体 上与HaloTag蛋白融合，再转染进入细胞，然后用甲醛处理细胞， 裂解细胞，用超声波将染色质剪切成小片段，再用HaloCHIP系统进 行纯化和后续分析。传统ChIP系统的最大挑战是很难找到一个能识 别交联后表型的高特异性抗体。在HaloCHIP系统中，与DNA交联 的重组HaloTag融合蛋白能直接被HaloLink树脂捕获，从而省去了 抗体。这个方法的另一个优势是HaloTag融合蛋白与HaloLink树月旨 的共价结合，在树脂、蛋白和DNA中间产生了一个完整的共价键。 这样就可以进行多次洗涤，背景低，信噪比高。与其他亲和标签不同 的是，
10、HaloTag蛋白也可以捕获细胞中丰度很低的复合物，因为 HaloTag融合蛋白与HaloLink树脂形成的共价键不会解离。 HaloTag融合蛋白与HaloLink树脂的结合快速，在几小时内就能完 成，节省了宝贵的实验时间。RocheRoche旗下的NimbleGen公司也提供一系列ChIP-chip (chromatin immunoprecipitation on chip)芯片和服务。 NimbleGen提供全基因组、启动子和客户定制的芯片，可以满足不 同的实验需要。全基因组ChIP-chip包含人、小鼠、大鼠、狗、鸡、 蠕虫、苍蝇、酵母、大肠杆菌和拟南芥基因组的非重叠区域，探针间 距
11、小于100bp，可用于发现启动子/增强子元件、转录因子结合、组 蛋白修饰/替换和Dnase-I超敏位点。NimbleGen的人和小鼠启动 子芯片根据最新发表的基因组数据设计,覆盖了所有已知基因的启动 子。分辨率高，灵敏度和特异性也非常理想，结果更加准确。AffymetrixAffymetrix公司的TilingArray （嵌合芯片）是迄今为止分辨率 最高的基因芯片类型TilingArray的探针设计几乎涵盖了目标DNA 的全部序列。目前为止，已经开发出了人、小鼠、酵母、线虫、拟南 芥等模式生物的全基因组Tiling芯片为全基因组规模上研究目的蛋 白与核酸的相互作用提供了强有力的分析工具Ge
12、neChipTili ng Array除了全基因组芯片外，还包括了专门应用于ChlP-chip技术中 的人启动子和小鼠启动子两款芯片/探针设计覆盖了转录起始位点附 近10kb的范围，针对肿瘤相关的1300个基因中，覆盖范围更增加 到12.5kb。此外，Affymetrix公司提供了包括GCOS, TAS和IGB 在内的完整的数据处理体系，为客户发表高质量的文章提供了强有力 的保障。IlluminaIllumina公司的Chip-Seq技术则融合了 ChIP与大规模并行的 DNA测序，来鉴定DNA相关蛋白的结合位点。Chip-Seq技术能够 精确划算地定位目的蛋白的所有结合位点。研究者可以在几乎
13、所有测 序过的生物中研究ChIP。起始样品量少，仅仅10ng就行。Illumina 公司的Chip-Seq不需要反复的探针设计和验证，比其他的ChIP方 法更高效，也比全基因组ChIP-chip更便宜。最近，Illumina公司 还和Genpathway宣布合作提供全基因组染色质免疫沉淀（ChIP） 测序服务。首先将用Genpathway的FactorPath ChIP实验来准备 样品，然后通过Illumina的测序服务进行测序。最终的数据分析由 Genpathway的专利软件分析工具来完成。Illumina和Genpathway 的联合服务为研究者提供了一套完整的ChIP测序解决方案，来鉴定
14、 和量化整个基因组上转录因子结合位点。abeamabeam公司不愧为真正的抗体王国扌是供了多种ChIP级别的抗 体，专门用于ChIP技术分析，节省去了前面摸索的步骤。除了高质 量的ChIP抗体外，abeam还提供详细的ChIP实验方法和该领域最 热门的文章，更使得您的实验如虎添翼。ChIP技术的详细信息请访 问：MilliporeMillipore旗下的Upstate公司最先开发出步骤优化简捷的商 业化ChIP分析试剂盒 保证实验的准确性和可重复性同时Upstate 提供广泛可行的ChIP级别应用抗体。ChIP基本试剂盒和特定蛋白质 ChIP级别应用抗体结合完成一个完整的染色质免疫沉淀分析。
15、MagnaChIP 丁试剂盒中用ProteinA或G的磁珠来进行免疫沉淀， 使整个操作步骤可以在1天内完成，同时试剂盒中包含了实验所需的 所有试剂（除了抗体），省时又省事。且提供了 DNA纯化柱，免去 了酚/氯仿抽提的烦恼。EZ-MagnaChIP 试剂盒除了包含上述所有 的特点，还包含了阳性、阴性对照抗体和对照引物，确保实验结果的 重复性和找出实验中的问题。再加上一个ChIP级别的抗体，Perfect!专家经验之谈阿肯色州医科大学生化和分子生物系副教授AlanTackett表示， 大家都知道酶的催化活性，但是没有人知道活性位点的位置。在他看 来，没有这门技术，就无法进行鉴定，也就不可能获得结
16、果。加州大 学药理学教授Peggy Farnham也认同这种观点。她说“如果不知 道哪些基因被调节，就不可能获得阳性对照。Farnham在研讨会上 向研究人员讲授ChlP-chip芯片技术新方法，采用该技术，她发现了 人类细胞中的新的转录因子结合位点。Farnham等人完成了一个转 录因子的ChIP-芯片的不完全定性过程“从0靶子到7,000个靶子， 然后我们能对被这些因子调节的基因进行分类。”与此同时，蛋白组学研究人员通常从已知的目标开始研究，需要 对关联的所有蛋白质进行鉴定和测试。因为DNA序列是公开的，所 以这些项目通常采用实时PCR方法进行检测，而不是DNA微阵列。例如，宾夕伐尼亚医学院的研究人员最近采用卡波济肉瘤相关疱 疹病毒(KSHV )的末端重复序列作为色谱柱 上的一个亲和标记，然后用柱子去纯化感染细胞的蛋白质。实验得出 的结果表明：与柱上的卡波济肉瘤相关疱疹病毒DNA结合的宿主蛋 白质有12
