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1、多花木蓝盐胁迫的生理响应试验方案材料和样品：多花木兰种子、NaCl、完全培养液（硝酸钙1 克、磷酸二氢钾0.25克、硫酸镁0.25克、氯化铁0.25克、氯 化钾或硝酸钾0.25克）、蒸馏水。溶液培养皿设置：设置5组不同培养条件，选择饱满、均匀、 外观良好的种子，放入溶液培养皿电每皿30粒，分别加入相同量 的完全培养液及6ml不同浓度的NaCl溶液（浓度梯度：0g/L、2 g/L、4 g/L、8 g/L、12 g/L），编号 1、2、3、4、5,第 1 组为 对照组，实验中每组设3个重复试验。将培养皿置于温室中培养，每天下午3时适当补充蒸发水分，以维 持盐分浓度的稳定。培养相同时长，待多花木蓝长
2、出幼苗后，分别 测定5组多花木蓝幼苗的各项指标。一、多花木蓝幼苗生长特性指标测定生长指标测定:记录每组植株成活数量，计算成活率；用直尺和游 标卡尺测量株高、茎粗、最大侧根长。根系活力的测定:TTC法材料、设备仪器及试剂（一）材料：水培的多花木蓝根系。（二）仪器设备：分光光度计；分析天平（感量0.1mg）;电子顶载天 平（感量0.1g）;温箱；研钵；三角瓶50ml;漏斗；量筒100ml;吸量 管10ml;刻度试管10ml;试管架；容量瓶10ml;药勺；石英砂适量; 烧杯 10ml、1000ml。(三) 试剂：1)乙酸乙酯(分析纯)；2)次硫酸钠(Na2S2O4),分析 纯，粉末;3) 1%TTC
3、溶液：准确称取TTC1.0g,溶于少量水中，定容 到100ml,用时稀释至各需要的浓度;4)磷酸缓冲液(1/15molL-1, pH7)。5) 1molL-1硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml,边搅 拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml; 6) 0.4molL-1琥珀酸：称取琥珀酸4.72g,溶于水中，定容至100ml 即成。三、实验步骤(1) TTC标准曲线的制作：取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶电 加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲腙。再用乙酸乙酯定 容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、 1.50
4、ml、2.00ml置10ml容量瓶电 用乙酸乙酯定容至刻度，即得到 含甲腙25 “g、50 “g、100 “g、150 “g、200 “g的标准比色系 列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。(2) 称取5组根尖样品各0.5g,每组取三次，分别编号11、12、13, 21、22、23, 31、32、33, 41、42、43, 51、52、53,放入 10ml 烧杯电加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml,把 根充分浸没在溶液内，在37C下暗保温1一3h,此后加入1mol IL-1 硫酸2ml,以停止反应。(与此同时做5个空白实验，先加硫酸，再 加根样品，其
5、它操作同上)。(3) 把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3一4ml和少量石英砂一起 在研钵内磨碎,以提出甲腙。红色提取液移入试管，并用少量乙酸 乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为 10ml,用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出 吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。四、结果计算四氮唑还原强度（mg.g-1根鲜重h-1）=四氮唑还原量（mg） /根重（g） x时间（h）叶绿素含量测定：分光光度法材料、仪器设备及试剂（一）材料：新鲜的多花木蓝叶片。（二）仪器设备：1.分光光度计；2.电子顶载天平（感量0.01g） ; 3. 研钵;4.棕色容量瓶;5.小漏
6、斗;6.定量滤纸;7.吸水纸;8.擦境纸;9.滴管。（三）试剂:96%乙醇（或80%丙酮）;石英砂；碳酸钙粉。三、实验步骤1. 取新鲜多花木蓝叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉）,混 匀。2. 称取5组剪碎的新鲜样品各0.2g,分别放入研钵中，加少量石英 砂和碳酸钙粉及2一3ml95%乙醇研成均浆，再加乙醇10ml，继续 研磨至组织变白。静置3一5min。3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗 中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残 渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直 全滤纸和残渣中
7、无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml,摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95%乙醇为 空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。四、实验结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A665 - 6.88A649Cb=24.96A649 - 7.32A665据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb: mg/L）,二者之 和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿 素的含量：叶绿素的含量（mg/g）=叶绿素的浓度x提取液体积x稀释倍数/ 样品鲜重（或干重）。二、多花木蓝幼苗生理指标测定超氧化物歧化酶SOD测定：氮蓝四唑（NBT）
8、比色法材料、仪器设备及试剂（一）材料：多花木蓝幼苗的叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机;2.分光光度计;3.微量进样器;4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx） ; 5.试管或指形管数支。（三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8） ; 2. 130mmol/L 甲硫 氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml; 3.750 “ mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至 100ml,避光保存；4. 100 “ mol/L EDTA - Na2 溶液：称取 0.03721gEDTANa2 用磷酸缓冲液定容至 1000
9、ml; 5. 20“mol/L 核 黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。实验步骤1. 酶液提取 取一定部位的多花木蓝叶片（视需要定，去叶脉） 0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加 缓冲液使终体积为5ml。取1.52ml于1000rpm下离心20min,上 清液即为SOD粗提液。2. 显色反应 取5ml指形管（要求透明度好）4支,2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各溶液试剂（酶）用量/ml终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met 溶液0.313mmol/L750 umol/L NBT 溶液0
10、.375umol/L100 u mol/L EDTA - Na2 液0.310 u mol/L20 u mol/L核黄素0.32.0u mol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应 20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。3. SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管做空 白，分别测定其它各管的吸光度。结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单 位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性=(Ack- AE) x V/(Ackx0.5xWxVt)式中
11、:Ack为照光对照管的吸光度,AE为样品管的吸光度,V为样品 液总体积(ml) Vt为测定时样品用量(ml) , W为样品鲜重(g),蛋白质含量单位为:mg蛋白/g鲜重。丙二醛(MDA)含量测定:硫代巴比妥酸法 材料、仪器设备及试剂1 .实验材料：多花木蓝幼苗的叶片2.仪器：分光光度计，研钵，剪刀，恒温水浴，试管20 mLx4,离心机。3.试剂:5 %三氯醋酸;0.5 %硫代巴比妥酸(用5 %三氯醋酸溶 解定容)；0.05 mol L 1 磷酸缓冲液 pH 7.8。实验步骤1 .取小麦植株上不同叶位的叶片35片，洗净擦干，剪成0.5 cm长的小段，混匀。2称取叶片切段0.3 g,放入冰浴的研钵
12、电加入少许石英砂和2 mL 0.05 mol L-1磷酸缓冲液，研磨成匀浆。将匀浆转移到试管中，再用3 mL 0.05 mol L-1磷酸缓冲液，分三次冲洗研钵，合并 提取液。3.在提取液中加入5 mL 0.5 %硫代巴比妥酸溶液，摇匀。4 .将试管放入沸水浴中煮沸10 min,（自试管内溶液中出现小 气泡开始计时）。到时间后，立即将试管取出并放入冷水浴中。5,待试管内溶液冷却后,3000 x g离心15 min,取上清液并量 其体积。以0.5 %硫代巴比妥酸溶液为空白测532 nm、600 nm和 450 nm处的消光值。3 .计算含量MDA（mmolg-iFW）=6.452x（D - D ）0.559kD x YL532600450 V X Ws式中,Vt:提取液总体积（mL） ; Vs:测定用提取液体积（ml） ; FW:样 品鲜重（g）。叶绿素含量测定:丙酮比色法叶片细胞电导率：将叶片样本在蒸馏水中浸泡8-10小时，再用电导 率仪测定。材料、仪器设备及试剂（）材料：小麦、女贞叶片；（二）仪器设备：1）电导仪;2）天平;3）温箱;4）真空干燥器;5）抽 气机;6）恒温水浴锅;7）注射器。（三）试剂:NaCl溶液实验步骤1）制作标准曲线：如需定量测定透性变化，可用纯NaCl配成0、
